Alginaatoligosahhariid leevendab D-galaktoosist põhjustatud südame vananemist, reguleerides müokardi mitokondrite funktsiooni ja terviklikkust hiirtel

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Abstraktne

Vananemine on oluline riskitegur vanusega seotud südame-veresoonkonna haiguste tekkeks. Seetõttu tuleb vananemise molekulaarseid mehhanisme ja uudseid vananemisvastaseid sekkumisi põhjalikult uurida. Alginaatoligosahhariidil (AOS) on kõrge farmakoloogiline toime ja kasulik toime. Meie uuring viidi läbi selleks, et uurida, kas AOS-i saab kasutada vananemisvastase ravimina, et leevendada südamehaiguse vananemist. D-galaktoosiga (D-gal) indutseeritud C57BL/6J vananevad hiired määrati D-gal (200 mg-kg'-d') subkutaanse süstimisega 8 nädala jooksul. AOS-i (50 100 ja 150 mg; kg'l.d') manustati intragastraalselt viimase 4 nädala jooksul. Selle tulemusena hoidis AOS ära südame düsfunktsiooni D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel, sealhulgas osaliselt säilinud väljutusfraktsiooni (EF protsenti) ja fraktsionaalset lühenemist (FS protsenti).cistanche benefíciosAOS inhibeeris natriureetilise peptiidi A (ANP), aju natriureetilise peptiidi (BNP) ja vananemismarkerite p53 ja p21 D-gal-indutseeritud ülesreguleerimist annusest sõltuval viisil. AOS-i vananemisvastasele kaitsvale toimele kaasaaitavate võimalike mehhanismide edasiseks uurimiseks analüüsiti vanusega seotud mitokondriaalset kompromissi. Meie andmed näitasid, et AOS leevendas D-gal-indutseeritud südame vananemist, parandades mitokondriaalset biogeneesi, säilitades mitokondriaalse terviklikkuse ja tõhustades kahjustatud mitokondrite tõhusat eemaldamist. AOS vähendas ka ROS-i tootmist ja oksüdatiivse stressi seisundit, mis omakorda pärsib veelgi südame mitokondrite hävitamist. Need tulemused näitavad koos, et AOS võib olla tõhus raviaine südame vananemise leevendamiseks.

MÄRKSÕNAD

alginaatoligosahhariid, südame vananemine, D-galaktoos, mitokondrid, oksüdatiivne stress

1|SISSEJUHATUS

Vananemist võib laias laastus määratleda kui ajast sõltuvat rakukahjustuste kuhjumist, mis põhjustab kudede ja elundite järkjärgulist funktsionaalset langust.¹ Üldiselt hõlmavad vanusega seotud muutused südames peamiselt vasaku vatsakese hüpertroofiat, suurenenud müokardi fibroosi ja südamepuudulikkust.Cistanche ekstrakti kiirgusvastane toimeVananemine on oluline riskitegur vanusega seotud südame-veresoonkonna haiguste tekkeks, mis toob kaasa südame-veresoonkonna haiguste märkimisväärselt suurenenud esinemissageduse vananeva elanikkonna seas.23 Seega on vananemisest põhjustatud südamepuudulikkuse raviks hädasti vaja tõhusamaid ravistrateegiaid. .

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

Alginaat on pruunvetikatest ekstraheeritud looduslik merevetikatest saadud polüsahhariid. Alginaatoligosahhariidi (AOS) toodetakse alginaadi depolümeriseerimisel, millel on mitu ainulaadset eelist, nagu vees lahustuv, mittetoksiline, mitteimmunogeenne ja biolagunev. AOS avaldab paljulubavat bioloogilist tegevust. Sellel oligosahhariidil on neuroprotektiivne, hüpolipideemiline, antioksüdatiivne, põletikuvastane, agregatsioonivastane, kasvajavastane, 10 antibakteriaalne ja immunoregulatoorsed omadused, samuti pärsib rasvumist¹ ja täiustatud glükoosi lõpp-produkti (AGE) aktiivsust. .4 Eelkõige ei ole uuritud AOS-i võimet kaitsta südame vananemise eest.

Mitokondrid on topeltmembraaniga organellid ja täidavad rakkude bioenergeetikas ja ainevahetuses mitmeid funktsioone.14 Süda on suure energiavajadusega ja suure mitokondrisisaldusega organ. Südame mitokondrid toodavad 90 protsenti ATP-st ja mängivad olulist rolli terve südame säilitamisel.cistanche herbaMitokondriaalne düsfunktsioon, mis võib kiirendada vananemisprotsessi imetajatel, on üks olulisemaid vananemise mehhanisme.15;16 Vanusega seotud mitokondriaalne düsfunktsioon näitab erinevaid tunnuseid, sealhulgas mitokondriaalse terviklikkuse kaotust, mitokondriaalse biogeneesi efektiivsuse vähenemist, defektset kvaliteeti. autofagia kontroll, vähenenud mitokondriaalse membraani potentsiaal (MMP), muutused mitokondriaalses dünaamikas, suurenenud reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) moodustumine ja mutatsioonide kuhjumine mitokondriaalses DNA-s (mtDNA).17Madalama biogeenide ja kliirensi vähenemise tõttu suurenenud kahjustuste ja vähenenud uuenemise kombinatsioon mitokondrites võib lõpuks kaasa aidata vananemisprotsessile.18,17 Lisaks põhjustab progresseeruv mitokondriaalne düsfunktsioon suurenenud ROS-i tootmist ja oksüdatiivset stressi, mis omakorda põhjustab edasist mitokondriaalset halvenemist ja rakukahjustust ning lõppkokkuvõttes vanusega seotud südame düsfunktsioonile.20

Cistanche on vananemisvastane toime

D-galaktoosi (D-gal) indutseeritud vananemisega seotud loomamudeleid on laialdaselt kasutatud vananemismehhanismide ja ravimite vananemisvastase toime uurimiseks.21 Suure koguse D-gal krooniline manustamine põhjustab rakkude metabolismi häireid ja rakkude vigastusi, mis kiirendavad vananemisprotsessi ja lõpuks põhjustada struktuurseid ja funktsionaalseid muutusi südame-veresoonkonna süsteemis.22 Seetõttu lõime käesolevas uuringus D-gal-indutseeritud hiire vananemismudeli, et süsteemselt hinnata AOS-i südame vananemisvastast aktiivsust ja täiendavalt uurida. võimalik alusmehhanism.

2|MATERJALID JA MEETODID

2.1|Ravimid ja reaktiivid

D-galaktoos saadi firmalt Sigma-Aldrich. AOS osteti ettevõttelt Qingdao BZ Oligo Biotech Co., Ltd. Malondialdehüüdi (MDA) analüüsikomplekt saadi ettevõttest Jiancheng Bioengineering Institute. Küüliku polüklonaalsed antikehad BNP, PGC-1a, p67-phox ja gp91-phox vastu saadi ettevõttelt Abcam Inc. Küüliku monoklonaalsed antikehad natriureetilise peptiidi A (ANP) ja SIRT3 vastu ja hiire p53 vastane monoklonaalne antikeha saadi ettevõttelt Abcam Inc. Küüliku polüklonaalsed antikehad beclin-1 ja p-mTOR vastu osteti ettevõttest Cell Signaling Technology. Küüliku p21 vastane polüklonaalne antikeha ja hiire p47-phox vastane monoklonaalne antikeha saadi ettevõttest Santa Cruz Biotechnology, Inc. Küüliku mTOR-vastased polüklonaalsed antikehad osteti ettevõttelt Proteintech Group, Inc. Mitokondriaalse ekstraheerimise komplekt ja JC{14} } mitokondriaalse membraani potentsiaali analüüsi komplekt osteti ettevõttelt Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. TIANamp Genomic DNA komplekt saadi ettevõttelt Tiangen Biotech (Beijing) CO., LTD.cistanche peenise kasvHiire mtDNA sondi PCR komplekt osteti ettevõttelt Beijing Tiandz Gene Technology CO., Ltd. Osteti kitse küülikuvastane IgG (H＋L) (konjugeeritud peroksidaas/HRP) ja kitse hiirevastane IgG (H pluss L) (konjugeeritud peroksidaas/HRP). Elabscience Biotechnology Co., Ltd. Kõik muud kemikaalid ja reaktiivid osteti tavalistelt kaubanduslikelt tarnijatelt, kui pole teisiti märgitud.

2.2|Loomad

Isased 8-nädalased C57BL/6J hiired (kehakaal 20±2 g,n=40) saadi ettevõttelt Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co, LTD. Kõiki hiiri toideti normaalse toiduga ja hoiti Qingdao ülikooli meditsiiniosakonna laboriloomade keskuses 12-tunnise valguse/12-tunnise pimeduse tsüklis spetsiifilistes patogeenivabades (SPF) tingimustes. . Kõik loomkatsete protseduurid vastasid laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhendile, mille on välja andnud USA riikliku tervishoiuinstituudi ja rahvatervise teenistuse poliitika inimsõbraliku hoolduse ja laboriloomade kasutamise kohta. Uuringuprotokollid kiitis heaks Qingdao ülikooli loomkatsete eetika komitee (kinnitusnumber: QYFYWZLL25840).

2,3|D-gal-indutseeritud vananemismudel ja ravimite manustamine

Hiired jaotati juhuslikult viide rühma (igas rühmas n =8): kontroll, D-gal, D-gal pluss väikeses annuses AOS (D-gal pluss AOS-50), D-gal pluss keskmise annusega AOS (D-gal pluss AOS-100) ja D-gal pluss suure annusega AOS (D-gal pluss AOS-150) rühmad. Vananemine indutseeriti C57BL/6J hiirtel D-gal (200 mg/kg, Sigma-Aldrich) subkutaanse süstimisega 8 nädala jooksul.23,24 Kontrollhiirtele süstiti subkutaanselt samaväärset steriilset vett. Neli nädalat pärast D-gal süstimist manustati rühmi D-gal pluss AOS-50, D-gal pluss AOS-100 ja D-gal pluss AOS-150 intragastraalselt koos AOS-iga ( vastavalt 50, 100 ja 150 mg-kg2-d'l) veel 4 nädala jooksul. Kontrollrühma ja D-gal rühma hiirtele manustati intragastraalselt samaväärset soolalahust.

2.4|Ehhokardiograafia

Ehhokardiograafia viidi läbi tuimastatud hiirtel, kasutades Vevo2100 (VisualSonics) katse lõpus 30-MHz muunduriga. Järgmisi parameetreid mõõdeti nagu eelnevalt kirjeldatud: vasaku vatsakese väljutusfraktsioon (EF) ja vasaku vatsakese fraktsionaalne lühenemine (FS).25

2,5|Histoloogiline analüüs

Südameproovid fikseeriti 4-protsendilise paraformaldehüüdiga 24 tundi, seejärel sisestati parafiini ja lõigati 4-um paksusteks osadeks. Südame arhitektuuri ja südamefibroosi visualiseerimiseks kasutati vastavalt H&E ja Massoni trikroomvärvimist. Lõike uuriti pöördvalgusmikroskoobi all (TE 200, Nikon). Vastavaid andmeid analüüsisid ja arvutasid uurijad, kes olid pimedad ravirühma määramise suhtes.

2,6|Transmissioonelektronmikroskoopia

Mitokondrite ultrastruktuur määrati ülekandeelektronmikroskoopia analüüsi abil. Eelmise uuringu järgselt lõigati 26 värsket vasaku vatsakese kudet 1 mm³ plokkideks ja fikseeriti 2,5% glutaaraldehüüdis 2 tunniks 4 kraadi juures. Pärast 2-tunnist toatemperatuuril 1-protsendilises osmiumtetroksiidis fikseerimist vasaku vatsakese kuded dehüdreeriti ja sisestati seejärel vaiku. Üliõhukesed lõigud (30-40 nm) koguti vaskvõredele ja värviti lõpuks 0,5% uranüülatsetaadiga, millele järgnes 1% pliitsitraadiga. Värvitud lõikude ultrastruktuurne analüüs määrati Tecnai G2 12 ülekandeelektronmikroskoopiaga (FEI Co.).

2,7|Mitokondriaalse membraani potentsiaali (MMP) määramine

Mitokondriaalse membraani potentsiaali mõõdeti JC-1 immunofluorestsentsvärvimise ja voolutsütomeetria abil. Külmutatud lõikude valmistamiseks või mitokondrite ekstraheerimiseks kasutati värskeid südamekudesid. JC-1 immunofluorestsentsvärvimiseks kasutati külmutatud sektsioone vastavalt tootja protokollile.cistanche salsa eelisedFluorestsents määrati ergastuse/emissiooni 485/580 nm (punane) ja ergastuse/emissiooni 485/530 nm (roheline) juures fluorestsentsmikroskoobi abil.

Lisaks eraldati mitokondrid värskest südamekoest, kasutades mitokondriaalse ekstraheerimise komplekti vastavalt Pengi jt poolt avaldatud meetodile. Seejärel kasutati ekstraheeritud mitokondreid MMP terviklikkuse tuvastamiseks, mõõtes JC{ fluorestsentsi intensiivsust. {2}}. Lühidalt, mitokondreid inkubeeriti JC-1-ga JC-1 analüüsipuhvris 10 minutit toatemperatuuril. MMP katkestamiseks kasutati karbonüültsüaniidi m-klorofenüülhüdrasooni ja see toimis positiivse kontrollina, järgides tootja juhiseid. Proove analüüsiti 488 ja 575 nm juures voolutsütomeetria abil, kasutades tarkvara CellQuest (Becton Dickinson).

2,8|mtDNA koopiaarvu mõõtmine

Mitokondriaalse DNA koopiate arvu mõõdeti kvantitatiivse reaalajas PCR-iga (qPCR). Lühidalt, südamekuded homogeniseeriti ja eemaldati valgud ja RNA-d, kasutades proteinaas K ja RNaasA. Kogu DNA-d ekstraheeriti TIANamp Genomic DNA komplektiga ja seejärel kvantifitseeriti QuickDrop spektrofotomeetriga firmast Molecular Devices (Holliston, MA). Proovi mtDNA amplifitseerimiseks fluorestsents-PCR tuvastamissüsteemiga (Hangzhou Bioer Technology Co. Ltd) kasutati hiire mtDNA sondi PCR komplekti. mtDNA koopiate arv arvutati qPCR positiivse kontrolli kõveralt vastavalt tootja protokollile.

2,9|ROS-i tootmise in situ tuvastamine

Nagu eelnevalt kirjeldatud, viidi läbi DHE fluorestsentsvärvimine, et hinnata ROS-i tootmise in situ taset.2³ Lühidalt, värsked südamekuded sisestati OCT ühendisse ja seejärel külmutati kohe krüostaadi abil -20 kraadi juures. Külmutatud südamekuded lõigati 6-um paksusteks histoloogilisteks slaidideks. Südamelõike pesti 1 x fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) ja inkubeeriti seejärel DHE (5 umol/L) lahusega valguse eest kaitstud niisutatud kambris 37 kraadi juures 30 minutit. Pärast inkubeerimist loputati põiki südamelõike 1 × PBS-ga. Lõpuks saadi pildid fluorestsentsmikroskoobiga ja fluorestsentsi intensiivsus kvantifitseeriti ImageJ tarkvara abil pimetesti abil.

2.10|Lipiidide peroksüdatsiooni mõõtmine

Lipiidide peroksüdatsiooni peamiste sekundaarsete oksüdatsiooniproduktidena mõõdeti malondialdehüüdi (MDA) kontsentratsioon seerumis ja südame homogenaatides vastavalt MDA analüüsikomplekti (Jiancheng Bioengineering Institute) juhistele.

2.11|Western blot analüüs

Südamekuded homogeniseeriti RIPA puhvris, mis sisaldas fosfataasi ja proteaasi inhibiitoreid, ja tsentrifuugiti 12 00 rpm juures 4 kraadi juures 20 minutit. Seejärel koguti supernatant järgmisteks katseteks. Valgu kontsentratsioon määrati BCA valguanalüüsi komplekti abil. Võrdsed kogused valke pandi 10-protsendilisse SDS-PAGE geeli ja kanti PVDF membraanidele (Roche). Membraanid blokeeriti tihenduslahusega 1 tund ja inkubeeriti vastavate primaarsete antikehadega 4 kraadi juures üleöö. Seejärel pesti membraane TBS-T-ga ja inkubeeriti sobivate sekundaarsete antikehadega. Seejärel pesti membraane TBS-T-ga ja visualiseeriti, kasutades ECL Western blot tuvastusreaktiive (Bio-Rad). Valgu ekspressioon kvantifitseeriti ribade densitomeetrilise analüüsi abil, kasutades ImageJ tarkvara. Laadimiskontrollina kasutati majapidamisvalku GAPDH. Primaarsete ja sekundaarsete antikehade lahjendussuhted näidati järgmiselt: ANP(1:1000),BNP(1:2000),p53(1:1000),p21 (1:1000),PGC-1 a (1:1000),SIRT3(1:1000),beclin-1(1:1000),p-mTOR(1:1000),mTOR (1:1000),p47-phox( 1:500),p67-phox(1:1000),gp91-phox(1:2000), GAPDH (1:2000), kitse küülikuvastane IgG (H ＋ L)(peroksüdaas) /HRP konjugeeritud) (1:5000) ja kitse hiirevastane lgG (H＋L) (peroksüdaas/HRP konjugeeritud) (1:5000).

2.12|Statistiline analüüs

Andmed väljendati keskmisena ± SEM. Statistiliselt oluline määrati ühesuunalise ANOVA abil, millele järgnes Student-Newman Keulsi (SNK) post hoc test.P<.05 was="" considered="" to="" be="" statistically="">

3|TULEMUSED

3.1|AOS-i mõju südamefunktsioonile ja vananemismarkerite ekspressioon D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel

Hiirte südamefunktsiooni analüüsimiseks kasutati ehhokardiograafiat. D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel vähenes oluliselt EF ja FS protsent. Siiski hoidis AOS märkimisväärselt ära südame düsfunktsiooni D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel, sealhulgas osaliselt säilinud EF-protsent ja FS-protsent (joonis 1A-C). Nagu on näidatud joonistel 1D-G, ei esinenud südame löögisageduses statistilist erinevust. iga rühm. D-galaktoosi hiirtel oli kalduvus suurendada LVEDD-d (vasaku vatsakese lõpp-diastoolne läbimõõt) ja LVPWd-d (vasaku vatsakese tagumise seina paksus diastooli lõpus), kuid statistiliselt olulist erinevust kontrollhiirtega võrreldes ei esinenud. Kuid LVESD (vasaku vatsakese lõpp-süstoolne diameeter) suurenes D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel oluliselt ja AOS vähendas LVESD-d annusest sõltuval viisil. ANP ja BNP ekspressioon südamekoes määrati Western blot abil, et täiendavalt kontrollida iga rühma hiirte südamefunktsiooni. Nagu on näidatud joonisel fig 1H-I, tõusid ANP ja BNP tasemed D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel märkimisväärselt ning AOS vähendas annusest sõltuval viisil märkimisväärselt ANP ja BNP taset. Need andmed näitasid, et AOS hoidis ära südame düsfunktsiooni D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel. Lisaks tuvastasime vananemismarkerite p53 ja p21 valgu ekspressiooni. Nagu oodatud, suurenes p53 ja p21 valgu ekspressioon märkimisväärselt D-gal-indutseeritud vananevate hiirte südamekudedes ja AOS vähendas oluliselt p53 ja p21 ekspressiooni annusest sõltuval viisil (joonis 1J-K).

3.2|AOS-i mõju südame histopatoloogilistele muutustele D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel

Hiirte müokardi arhitektuuri muutuste uurimiseks värviti südamekoe slaidid hematoksüliini ja eosiiniga (H&E). Nagu on näidatud joonisel fig 2A, oli D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel kontrollhiirtega võrreldes ebanormaalne müokardi arhitektuur, mida iseloomustas peamiselt kardiomüotsüütide ebakorrapärane paigutus ja suurenenud rakkudevaheline ruum. AOS-i manustamine vähendas märkimisväärselt kardiomüotsüütide ebakorrapärast paigutust ja ruumi. H&E värvimine näitas ka, et vasaku vatsakese kardiomüotsüütide pindala suurenes oluliselt D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel ja AOS-ravi vähendas oluliselt kardiomüotsüütide pindala annusest sõltuval viisil (joonis 2B, D).

Südamefibroosi astme selgitamiseks viidi läbi Massoni südame ristlõigete tri-kroomvärvimine. Nagu on näidatud joonisel fig 2C, E, suurenes kollageeni akumulatsioon müokardi interstitsiaalsetes ja perivaskulaarsetes piirkondades D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel dramaatiliselt. Kuid võrreldes D-gal rühmaga vähendas AOS-ravi annusest sõltuval viisil oluliselt kollageeni pindala protsenti (joonis 2C, E). Need andmed näitasid, et AOS hoidis C57BL / 6J hiirtel ära D-gal-indutseeritud morfoloogilisi muutusi ja südamefibroosi.

3,3|AOS-i mõju D-gal-indutseeritud vananevate hiirte südame mitokondriaalsele ultrastruktuurile

Järgmisena kasutasime südame mitokondriaalse ultrastruktuuri muutuste tuvastamiseks transmissioonielektronmikroskoopiat. Nagu on näidatud joonisel fig 3, olid kontrollhiirte kardiomüotsüütide mitokondrid struktuurselt normaalsed ja neil oli selgelt eristatav kristall ja elektron-lutsents maatriks. Siiski suurenesid mõned D-gal hiirte kardiomüotsüütide mitokondrid, paistetus ja osaline kristade kadumine ning AOS-ravi hoidis ära südame mitokondriaalse ultrastruktuuri hävimise D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel.

3,4|AOS-i mõju D-gal-indutseeritud vananemise hiirte südame MMP-le

Mitokondrite funktsionaalse seisundi olulise määrajana mõõdeti MMP-d, kasutades JC-1 fluorestsentsvärvimist ja voolutsütomeetriat. Üldiselt, kui mitokondrite membraanipotentsiaal on kõrge, agregeerub JC-1 mitokondritesse ja kiirgab punast fluorestsentsi, samas kui JC-1 eksisteerib monomeerina tsütosoolis ja kiirgab rohelist fluorestsentsi, kui mitokondrid on madala membraanipotentsiaaliga.29 punase fluorestsentsi ja rohelise fluorestsentsi suhe võib peegeldada MMP intensiivsust. Nagu on näidatud joonistel 4A-B, näitas JC-1 fluorestsentsvärvimise tulemus, et südame MMP tase D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel oli dramaatiliselt madalam kui kontrollhiirtel ja AOS-i manustamine oli kaitstud D-ga seotud hiirte vastu. galaktoosi poolt vahendatud MMP langus. sisse

3,5|AOS-i mõju mitokondriaalsele biogeneesile ja autofagia valgu ekspressioonile D-gal-indutseeritud vananevate hiirte südametes

Mi-tokondrite biogeneesi markeri PGC-1a valgu ekspressiooni määramiseks kasutasime Western blot meetodit. Ootuspäraselt täheldati D-gal-indutseeritud vananevate hiirte südamekudedes olulist PGC-1o valgu ekspressiooni vähenemist ja AOS suurendas märkimisväärselt PGC-1a ekspressiooni annusest sõltuvatel hiirtel. viisil (joonis 5A-B). Uuringud on näidanud, et SIRT3 mängib olulist rolli mitokondriaalse bioenergeetika säilitamisel. Seetõttu tuvastasime täiendavalt SIRT3 ekspressiooni südamekudedes. Meie tulemus näitas, et SIRT3 valgu ekspressiooni märkimisväärne vähenemine D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel ja AOS suurendasid oluliselt SIRT3 valgu ekspressiooni annusest sõltuval viisil (joonis 5C-D). Veelgi enam, mtDNA sondi PCR tulemus näitas, et mtDNA koopiate arv vähenes oluliselt D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel ja AOS suurendas oluliselt mtDNA koopiate arvu annusest sõltuval viisil (joonis 5E). Need andmed näitasid, et AOS reguleeris mitokondriaalset biogeneesi D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel.

Järgmisena kasutasime südame kudedes kriitiliste autofagia regulaatorite ekspressiooni ja fosforüülimise määramiseks Western blot'i. Nagu on näidatud joonisel 5F-I, täheldati D-gal-indutseeritud vananevate hiirte südamekudedes bekliin-1 valgu ekspressiooni olulist vähenemist ja mTOR-i fosforüülimise olulist suurenemist. Ootuspäraselt suurendas AOS annusest sõltuval viisil oluliselt bekliin{5}} ekspressiooni ja vähendas mTOR-i fosforüülimist.

3,6|AOS-i mõju ROS-i tootmisele ja oksüdatiivsele stressile D-gal-indutseeritud vananevate hiirte südametes

Määrasime ROS-i tootmise südametes, kasutades DHE fluorestsentsvärvimist. Nagu on näidatud joonisel fig 6A-B, leidsime, et vasaku vatsakese kardiomüotsüütide DHE fluorestsentsi intensiivsus oli D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel märkimisväärselt suurenenud ja AOS vähendas oluliselt vasaku vatsakese kardiomüotsüütide DHE fluorestsentsi intensiivsust.

Et uurida AOS-i mõju oksüdatiivse stressi seisundile D-gal-indutseeritud vananevate hiirte südametes, kasutasime NADPH oksüdaasi valgu ekspressiooni määramiseks südamekudedes Western blot meetodit. NADPH oksüdaasi subühiku p47-phox,p67-phox ja gp91-phox ekspressioon suurenes oluliselt D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel. Kuid AOS vähendas nende NADPH oksüdaasi subühikute ekspressiooni annusest sõltuval viisil (joonis 6C-D).

Kuna MDA-d peetakse elusorganismide lipiidide peroksüdatsiooni eeldatavaks biomarkeriks, tuvastasime oksüdatiivse stressi seisundi hindamiseks in vivo MDA kontsentratsiooni. Nagu on näidatud joonisel fig 6E-F, kinnitas D-gal-indutseeritud vananevate hiirte suurenenud oksüdatiivse stressi staatus MDA kõrgema kontsentratsiooniga seerumi ja südame homogenaatides. AOS-i manustamine vähendas MDA taset annusest sõltuval viisil võrreldes D-gal rühmaga. Need andmed näitasid ühiselt, et AOS vähendas oluliselt ROS-i tootmist ja oksüdatiivse stressi seisundit D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel.

4|ARUTELU

Vananemine on kroonilised ja mitme elundiga seotud süsteemsed muutused organismis. Vananemisega seotud südame-veresoonkonna haiguste sagenemine ja sellest tulenev rahaline koormus on muutunud valdavaks ülemaailmseks väljakutseks.30,31 Seetõttu tuleb südame vananemise molekulaarseid mehhanisme põhjalikult uurida ja uudsed vananemisvastased sekkumised on väga olulised. parandada tervislikku seisundit ja aeglustada vananemisest tingitud südamepuudulikkust.

Alginaat on pruunvetikatest ekstraheeritud polüsahhariidide lineaarne kopolümeer. Suure molekulmassi ja viskoossuse tõttu on alginaadil raske läbida rakumembraane ja bioloogilisi tõkkeid, mis piirab selle kasutamist. Alginaadi hüdrolüüsist saadud AOS on pälvinud üha suuremat tähelepanu oma väiksema molekulmassi ja viskoossuse tõttu. AOS on vees lahustuv, mittetoksiline, mitteimmunogeenne ja biolagunev ühend ning sellel on palju parem bioloogiline aktiivsus kui alginaadil. Tõendid näitavad, et AOS-il kui antioksüdant-oligosahhariidil on võime kaitsta neurodegeneratiivseid haigusi ja ägedat doksorubitsiini kardiotoksilisust, pärssides endoplasmaatilise retikulumi stressi ja oksüdatiivset stressi.5 Hiljutised uuringud on näidanud, et merest pärit AOS on paljulubav bioloogiline toime vähendamisel. hüperlipideemia, hüperglükeemia ja hüpertensioon ning rasvumise pärssimine.27 Siiski ei ole tõestatud AOS-i võimet kaitsta vananemise eest.

Varasemad uuringud näitavad, et vananeval südamel on ainulaadsed histoloogilised ja funktsionaalsed omadused, sealhulgas südame progresseeruv ümbermodelleerimine ja südamereservi halvenemine.25,32 Südame sisemine vananemine võib lõpuks põhjustada haavatavuse suurenemist erinevate stressitegurite suhtes ja soodustada kardiovaskulaarsete haiguste teket. . D-gal-indutseeritud enneaegse vananemise mudelid näitavad sarnaseid südame muutuste fenotüüpe võrreldes näriliste loomuliku vananemisega.*4 Selles uuringus näitasime, et D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel ilmnes ebanormaalne müokardi struktuur ja suurenenud kollageeni akumuleerumine müokardi interstitsiaalses piirkonnas. ja perivaskulaarsetes piirkondades ning AOS-i manustamine inhibeeris C57BL/6J hiirtel D-gal poolt indutseeritud südame remodelleerumist. Vahepeal avastasime, et AOS hoidis ära südame düsfunktsiooni D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel, sealhulgas osaliselt säilinud EF protsenti ja FS protsenti ning vähendas ANP ja BNP ekspressiooni. Ehhokardiograafiat kasutati ka hiirte südame struktuuri muutuste analüüsimiseks. D-galaktoosi hiirtel oli kalduvus LVEDD ja LVPWd suurenemisele, kuid statistiliselt olulist erinevust kontrollhiirtega võrreldes ei esinenud. Kuid LVESD suurenes oluliselt D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel ja AOS vähendas LVESD-d annusest sõltuval viisil. Selle nähtuse põhjuseks võib olla see, et D-galaktoosi jäljendaval kiirendatud vananemismudelil on suhteliselt lühike modelleerimisaeg, mis mõjutab peamiselt mitokondriaalset funktsiooni, nagu allpool näidatud, ja põhjustab südame düsfunktsiooni. Toimusid suured südame struktuuri muutused, kuid need ei toonud kaasa statistiliselt olulisi erinevusi. Lisaks näitasid meie andmed, et AOS-i manustamine vähendas annusest sõltuval viisil oluliselt vananemismarkerite p53 ja p21 ekspressiooni. AOS-i vananemisvastasele kaitsevõimele kaasaaitavate võimalike mehhanismide edasiseks uurimiseks analüüsiti vanusega seotud mitokondriaalset kompromissi.

Süda sisaldab arvukalt mitokondreid, mis põhinevad selle erakordsel nõudlusel ATP järele. Mitokondrid toodavad ATP-d rasvhapete ja süsivesikute oksüdatiivse fosforüülimise kaudu. Lisaks tekivad selle protsessi käigus pidevalt ka vabad radikaalid. Väärib märkimist, et mitokondriaalne homöostaas on kardiomüotsüütide funktsiooni ja elujõulisuse säilitamiseks ülioluline. 3 kraadi Tõepoolest, sõltumatud uuringud vananeva südamega on näidanud, et kardiomüotsüütide mitokondrid kahjustuvad vananemise käigus.3738 Vanade näriliste ultrastruktuurne morfomeetriline analüüs. müokard näitab laienenud ja paisuvate mitokondrite olemasolu koos maatriksi häirega ja cristae kadumisega." Selles uuringus olid D-gal hiirte mõned kardiomüotsüütide mitokondrid võrreldes kontrollhiirtega suurenenud, paistetus ja kristade osaline kadu. AOS-ravi leevendas südame mitokondriaalse ultrastruktuuri hävimist D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel. Samal ajal kutsus D-gal esile südame MMP taseme olulise languse ja AOS-i manustamine kaitses D-gal-vahendatud hiirte eest. Need tulemused näitasid, et AOS takistas südame mitokondrite hävitamist D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel.

On täheldatud, et vananenud südame patogeneesis on seotud mitmed kahjustatud mitokondriaalsed protsessid, sealhulgas mitokondriaalse biogeneesi ja eemaldamise muutumine. Samal ajal suurendab mitokondriaalne düsfunktsioon ja hävitatud mi-tokondrite eemaldamise halvenemine omakorda vananenud südame haavatavust stressikahjustuste suhtes." Mitokondriaalset biogeneesi reguleerivad peamiselt tuumakodeeritud koaktivaatorid ja transkriptsioonifaktorid. Peroksisoomi proliferaatori poolt aktiveeritud retseptor y Koaktivaator 1a (PGC-1a), mis on oluline energia homöostaasi säilitamiseks, mängib võtmerolli mitokondriaalse biogeneesi ja funktsiooni reguleerimisel.4 Vähenenud PGC-1a ekspressioon ja aktiivsus on omavahel seotud südame-veresoonkonna vananemisele ja südamepuudulikkuse tekkele."2 Eelnev uuring näitab, et vanusega seotud p53 aktiveerimine põhjustab otseselt mitokondriaalset kompromissi, represseerides mitu mitokondriaalse biogeneesi põhiregulaatorit, sealhulgas PGC-1a. 43 Koguvad tõendid viitavad ka sellele, et PGC{15}o aktiveerimine farmakoloogilise või geneetilise sekkumise teel hoiab ära vananemisega seotud muutused südames." Sirtuiinid (SIRT) on tunnustatud vananemisprotsessi asendamatute regulaatoritena. Mitokondriaalses maatriksis paiknev SIRT3 mängib olulist rolli mitokondriaalse bioenergeetika säilitamisel, mitokondriaalse metabolismi moduleerimisel ja eluea reguleerimisel. On näidatud, et Sirt3 puudulikkus põhjustab hiirtel südamehäireid ja kahjustab mitokondriaalset bioenergeetikat. 45 Selles uuringus näitasime, et D-gal-indutseeritud vananevate hiirte südamekudedes täheldati PGC-1a ja SIRT3 valgu ekspressiooni olulist vähenemist ja AOS suurendas oluliselt PGC-1a. ja SIRT3 valgu ekspressioon annusest sõltuval viisil. Lisaks näitas mtDNA sondi PCR tulemus, et mtDNA koopiate arv vähenes oluliselt D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel ja AOS suurendas oluliselt mtDNA koopiate arvu annusest sõltuval viisil. Kokkuvõttes näitasid need andmed, et AOS reguleeris mitokondriaalset biogeneesi D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel.

Nagu eespool märgitud, on kahjustatud mitokondrite tõhus eemaldamine kardiomüotsüütide homöostaasi säilitamiseks ülioluline. Tuntud mehhanism, mille abil mitokondrid ümber pööratakse, on autofagia. Arvatakse, et autofagia mängib kriitilist rolli nii südame homöostaasi reguleerimisel basaalseisundis kui ka vastusena stressile.46,47 Kuid autofagia on vananevas südames üldiselt allareguleeritud. Madalam autofagia tase vananemisprotsessi ajal vähendab hävitatud organellide ja toksiliste valkude lagunemist ning kutsub esile düsfunktsionaalsete ja ebanormaalsete mitokondrite kuhjumise, mis lõpuks põhjustab globaalset südame talitlushäiret. On näidatud, et autofagia stimuleerimine parandab näriliste mudelites südamefunktsiooni, eemaldades düsfunktsionaalsed mitokondrid, optimeerides seeläbi üldist rakukeskkonda ja lõpuks leevendades vananemisega seotud patoloogiat südames.48 Selles uuringus näitasime, et autofagia tase vähenes südames oluliselt. D-gal-indutseeritud vananevate hiirte kudedes ja AOS suurendas oluliselt autofagia taset annusest sõltuval viisil. Need muutused näitasid, et AOS suurendas vanusega seotud kahjustatud mitokondrite tõhusat eemaldamist autofagia ülesreguleerimise kaudu. Nagu eelnevalt mainitud, tekib suurem osa mitokondriaalsete elektronide transpordiahela (ETC) kompleksidest genereeritud ROS-i tootmisest mitokondriaalse oksüdatiivse fosforüülimise kõrvalsaadusena.4 Eksperimentaalsed tõendid näitavad, et kahjustatud mitokondrid tekitavad vananemise käigus suuremaid koguseid. ROS-i, suurendab vabade radikaalide tekitatud kahjustusi ja viib lõpuks mitokondriaalse lagunemise progresseeruva edasi-tagasiside spiraalini.4 See omakorda põhjustab ETC kahjustamise kaudu rohkem ROS-i, indutseerides edasist ROS-i tootmist ja lõpuks põhjustades bioenergeetika rikke. . Lisaks ETC-le on nikotiinamiidadeniindinukleotiidfosfaat (NADPH) oksüdaas ROS-i peamine ekstramitokondriaalne allikas, mis võib olla vastutav oksüdatiivse stressi eest vananemisprotsessi ajal ja süvendada mitokondrite oksüdatiivset kahjustust. Lisaks nendele mehhanismidele on hiljutised uuringud näidanud ka seda, et madalam mitokondriaalne ROS-i teke põhjustab mtDNA püsiseisundi kahjustuse madala taseme.47 Suurem mitokondriaalse baasi ekstsisiooni parandamine (BER) ja pikaealiste imetajate madal mitokondriaalne kahjustus. üldine aitab kaasa nende suurepärasele pikaealisusele. Hiljutine aruanne näitab, et NADPH oksüdaasi inhibiitor pärsib mitokondriaalse düsfunktsiooni D-gal-indutseeritud vananevate rottide ventraalses kohleaarses tuumas. MDA-d peetakse elusorganismide lipiidide peroksüdatsiooni eeldatavaks biomarkeriks ja MDA kontsentratsiooni saab kasutada oksüdatiivse stressi seisundi hindamiseks in vivo. Selles uuringus leidsime, et AOS-i manustamine nõrgendas ROS-i tootmist, vähendas NADPH oksüdaasi ekspressiooni ja vähendas MDA taset D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel. Meie praegused tulemused näitasid, et AOS vähendas tõhusalt oksüdatiivse stressi seisundit D-gal-indutseeritud vananevatel hiirtel, mis võib olla AOS-i jaoks veel üks oluline kaitsefaktor mitokondriaalse kahjustuse leevendamiseks.

Käesolevas uuringus selgitasime kõigepealt, et AOS leevendab D-gal-indutseeritud südame vananemist, parandades mitokondriaalset biogeneesi, säilitades mitokondriaalse terviklikkuse ja tõhustades kahjustatud mitokondrite tõhusat eemaldamist C57BL / 6J hiirtel. Lisaks vähendab AOS ka ROS-i tootmist ja oksüdatiivse stressi seisundit, mis omakorda pärsib veelgi südame mitokondrite hävitamist. AOS võib olla tõhus raviaine südame vananemise leevendamiseks. Selles uuringus kasutasime ainult isaseid hiiri ja ei uurinud AOS-i mõjude soolisi erinevusi. On väga huvitav, et dendriitraku-spetsiifiline rakkudevaheline adhesioonimolekul{7}}haarab mitteintegriini (DC-SIGN) ligandi 1 (DSCL1, põletikuvastane aine) ravi vähendab makrofaagide polarisatsiooni ja diastoolset düsfunktsiooni vananeva emase, kuid mitte isase hiire südames.52 See artikkel viitab sellele, et sooerinevuste võrdlemine tulevastes uuringutes oleks väga oluline.

Kokkuvõttes näitasid meie leiud, et AOS leevendas D-gal-indutseeritud südame vananemist, reguleerides müokardi mitokondrite funktsiooni ja terviklikkust hiirtel. AOS-il on lai valik paljulubavaid bioloogilisi toimeid ja see võib olla tõhus raviaine südame vananemise leevendamiseks.

See artikkel on välja võetud J Cell Mol Medist. 2021;25:7157–7168. wileyonlinelibrary.com/journal/jcmm|7157