Hingamisteede kaudu manustatud lühikese ahelaga rasvhappeatsetaat suurendab viirusevastast immuunsust rinoviirusnakkuse ajal

Taust: 

On teada, et mikrobiota mängib olulist rolli immuunsuse reguleerimisel immunomoduleerivate metaboliitide, näiteks lühikese ahelaga rasvhapete (SCFA) vabanemise kaudu. Rinoviirused (RV-d) indutseerivad ülemiste hingamisteede haigusi ja põhjustavad astma ja kroonilise obstruktiivse kopsuhaiguse ägenemist halvasti mõistetavate mehhanismide kaudu. Kohalikke koostoimeid SCFA-de ja viirusevastaste immuunvastuste vahel hingamisteedes ei ole varem uuritud.

Lühiahelalised rasvhapped (SCFA-d) on orgaanilised happed, mis tekivad tselluloosi ja teiste toidukiudude kääritamisel soolestiku kasulike bakterite poolt. Uuringud on näidanud, et SCFA-del on oluline mõju inimese immuunsüsteemile.

Esiteks võivad SCFA-d edendada soole limaskesta barjääri terviklikkust ja suurendada soolebarjääri funktsiooni. Soolebarjäär on esimene kaitseliin soolekeskkonna kaitsmiseks. Kui soolebarjäär on kahjustatud, võivad kahjulikud ained sattuda sooleseina kaudu vereringesse, põhjustades põletikku ja ebanormaalset immuunsüsteemi. Uuringud on leidnud, et SCFA-d võivad suurendada soolebarjääri terviklikkust ja vähendada soolepõletiku riski, soodustades limaskestarakkude diferentseerumist ja proliferatsiooni, suurendades limaskesta paksust ja lima tootmist.

Teiseks on SCFA-de funktsioon immuunrakkude reguleerimine. Uuringud on näidanud, et SCFA-d võivad soodustada immuunrakkude diferentseerumist ja proliferatsiooni ning reguleerida immuunrakkude funktsiooni. SCFA-d võivad samuti vähendada põletikuliste tsütokiinide tootmist ja pärssida immuunrakkude aktiivsust, kaitstes seeläbi inimese immuunsüsteemi. Teised uuringud on samuti leidnud, et SCFA-d võivad reguleerida T-rakkude funktsiooni, suurendada autoimmuunfunktsiooni ja mängida teatud rolli autoimmuunhaiguste ennetamisel ja ravis.

Lühidalt öeldes mängivad lühikese ahelaga rasvhapped olulist rolli inimese immuunsüsteemi normaalses talitluses. Tähelepanu tuleks pöörata toidustruktuuri mõistlikule kombinatsioonile, mis sisaldab rohkesti kiudaineid, et suurendada kasulike bakterite arvu ja mitmekesisust soolestikus, soodustades seeläbi SCFA-de tootmist ning säilitades inimese immuunsüsteemi stabiilsuse ja tervise. Sellest vaatenurgast peame oma immuunsust parandama. Cistanche võib oluliselt parandada immuunsust, sest Cistanche on rikas mitmesuguste antioksüdantsete ainete poolest, nagu C-vitamiin, C-vitamiin, karotenoidid jne. Need koostisosad võivad vabu radikaale eemaldada ja oksüdatiivset stressi vähendada. Stimuleerida ja parandada immuunsüsteemi vastupanuvõimet.

Click cistanche tubulosa eelised

Eesmärk:

Püüdsime uurida, kas kopsu metaboliitidega manipuleerimine SCFA-de manustamise kaudu võib moduleerida viirusevastast immuunsust RV-nakkuse vastu.

Meetodid:

Uurisime SCFA-de atsetaadi, butüraadi ja propionaadi intranasaalse manustamise mõju viirusevastaste signatuuride ja atsetaadi põhiekspressioonile RV infektsiooni hiiremudelis ja RV-ga nakatunud kopsuepiteeli rakuliinides. Lisaks hindasime atsetaadi, butüraadi ja propionaadi mõju RV infektsioonile inimese diferentseeritud primaarsetes bronhide epiteelirakkudes.

Tulemused:

Intranasaalne atsetaadi manustamine kutsus esile IFN-b basaalse ülesreguleerimise, mida teiste SCFA-de puhul ei täheldatud. Butüraadi poolt indutseeritud RIG-I ekspressioon. Hiirte intranasaalne atsetaatravi suurendas interferooniga stimuleeritud geeni ja IFN-l ekspressiooni RV-nakkuse ajal ning vähendas kopsuviiruse koormust 8 tundi pärast nakatumist. Atsetaat leevendas viiruse poolt indutseeritud põletikueelseid reaktsioone koos nõrgenenud kopsumutsiini ja IL-6 ekspressiooniga, mida täheldati 4. ja 6. päeval pärast nakatumist. See atsetaadi interferooni võimendav toime leidis kinnitust inimese bronhide ja alveolaarsete epiteelirakkude liinides. Diferentseeritud primaarsetes bronhide epiteelirakkudes moduleeris ravi butüraadiga paremini IFN-b ja IFN-l geeniekspressiooni RV infektsiooni ajal.

Järeldused:

SCFA-d suurendavad viirusevastast immuunsust ja vähendavad viiruskoormust ja põletikueelseid reaktsioone RV-nakkuse ajal. (J Allergy Clin Immunol 2023;151:447-57.)

Limaskesta pindadel (mikrobioot) esinevad bakterite kooslused mängivad keskset rolli immuunsüsteemi homöostaasis ning määravad vastust põletikulistele ja nakkushaigustele, sealhulgas astmale, koliitidele ning bakteriaalsetele ja viirusnakkustele.{0}} Bakterite metaboliidid, nt lühiahelalised rasvhapped (SCFA-d), peamiselt atsetaat, butüraat ja propionaat, on nüüd hästi tunnustatud seos soolestiku mikrobiota ja peremeesrakkude vahel.6,7 Need molekulid tekivad toidukiudude metabolismi kaudu soolestiku mikrobiota komponentide poolt. SCFA-del on nii lokaalne kui ka süsteemne toime. Nad moduleerivad immuunrakkude aktiveerimist ja funktsiooni mehhanismide kaudu, sealhulgas G-valguga seotud retseptorite (st Gpr41, Gpr43 või Gpr109a) aktiveerimine ja histooni deatsetülaaside pärssimine, ning on näidatud, et need soodustavad limaskesta homöostaasi ja suukaudset taluvust. Hiljuti on kirjeldatud mikrobiota olemasolu alumistes hingamisteedes ja uued tõendid näitavad, et respiratoorsed kommensaalid on ka metaboolselt aktiivsed organismid, mis on võimelised tootma immunomoduleeriva võimega metaboliite, nagu SCFA-d.8 Seega vabanevad SCFA-d kas lokaalselt kopsu mikrobiota või soolestiku mikrobiotast pärinevad ained võivad mängida olulist rolli immuunsuse reguleerimisel. SCFA-de viirusevastane toime rinoviiruste (RV-de) vastu on aga teadmata.

RV-d põhjustavad kogu maailmas tohutut nakkushaiguste hulka, põhjustades tervetel inimestel kergeid iseeneslikult taanduvaid külmetushaigusi ja ägenemisi krooniliste kopsuhaigustega inimestel, nagu astma või krooniline obstruktiivne kopsuhaigus (KOK). Need haigused põhjustavad kogu maailmas tervishoiu infrastruktuuridele märkimisväärseid majanduslikke kulusid. Praegu ei ole RV-de jaoks tõhusaid ravimeetodeid ega litsentseeritud vaktsiine, kuna serotüüpide/tüvede suur valik on esitanud teadusuuringutele olulisi väljakutseid.9 Seetõttu on RV-nakkuste jaoks kiiresti vaja välja töötada uued ennetavad ja ravimeetodid. Soolestiku mikrobioomi saab terapeutiliselt manipuleerida, et pakkuda kliinilist kasu soolestiku nakkushaiguste (nt Clostridium difficile) korral. Hingamisteede kommensaalide või nendega seotud metaboliitide manustamise potentsiaali kopsude antimikroobse immuunsuse sarnaseks suurendamiseks on veel uurimata.

Oleme varem näidanud, et kiudainerikka dieedi või SCFA-de atsetaadi, butüraadi ja propionaadi manustamine kaitses hiiri respiratoorse süntsütiaalviiruse (RSV) nakkuse eest.5 Atsetaadi suukaudne manustamine kutsus esile IFN-b produktsiooni ja suurendas interferooniga stimuleeritud geenide ekspressiooni ( ISG-d) kopsudes RSV-nakkuse ajal. Lisaks avastasime, et otse hingamisteedesse manustatud atsetaat kaitseb RSV-nakkuse eest, suurendades ISG-de ekspressiooni kopsus.11 Seetõttu oletasime, et atsetaadi otsene manustamine hingamisteedesse, et suurendada kohalike mikroobsete metaboliitide kontsentratsiooni, omaks sarnast kaitset. mõju RV infektsioonile. Siin näitame, et atsetaadi in vivo manustamine hiirtele suurendab viirusevastaseid I ja III tüüpi interferoone (IFN-e), vähendab RV replikatsiooni ja nõrgestab viiruse poolt indutseeritud immunopatoloogiat. Arvestades spetsiifiliste rakutüüpide in vitro viirusevastast vastust laiemale SCFA-de valikule, leiame, et need ühendid ei mõjuta alveolaarsete makrofaagide IFN vastuseid ja neil on erinev toime epiteelile, kusjuures butüraadiga võrreldes on täheldatud tugevamat viirusevastast toimet. koos teiste SCFA-dega, mis viitab sellele, et in vivo efektid võivad olla tingitud keerukamatest raku-rakkude interaktsioonidest. Need andmed viitavad sellele, et kopsu mikroobse metaboliidi miljööga manipuleerimine võib olla uudne lähenemisviis hingamisteede viirusnakkuste ennetamisele või ravile.

MEETODID

Eetikaavaldus

Kõik loomkatsed viidi läbi vastavalt 1986. aasta loomade seadusele ja ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) juhistele, järgides Ühendkuningriigi siseministeeriumi juhistega heaks kiidetud protokolli (Ühendkuningriigi projektilitsents PPL nr P07D80C24).

RV levik ja kvantifitseerimine

Hiire ja inimese rakuliini uuringute jaoks kasvatati väikerühma RV serotüüp A1 (RV-A1) Ohio HeLa rakkudes (Euroopa rakukultuuride kollektsioon). Nakatunud rakud koguti 24 tunni pärast ning viirus kontsentreeriti ja puhastati ning viiruse tiitri hindamiseks viidi läbi TCID50 (50% koekultuuri infektsioosne doos) test, nagu eelnevalt kirjeldatud.12 Inimese primaarsete bronhiaalepiteelirakkude (BEC) uuringute jaoks. RV-A1 paljundati RD-ICAM-1 rakkudes, mis pärinevad kliinilistest proovidest eraldatud ettevõttesisesest varust ja sekveneeriti identiteedi kinnitamiseks. RV-A1 tiitriti, nakatades RD-ICAM{16}} rakku seeriaviisiliselt lahjendatud RV-A1-ga, millele järgnes tsütopaatiliste mõjude vaatlus ja TCID50 analüüs viiruse tiitri hindamiseks.

Hiireõpe

Kuue nädala vanused emased BALB/c hiired osteti ettevõttest Harlan Laboratories (Derby, Ühendkuningriik) ja neid hoiti Londoni Imperial College'is (Ühendkuningriik) spetsiifilistes patogeenivabades tingimustes. Hiiri töödeldi intranasaalselt 50 ml naatriumatsetaadi, butüraadi või propionaadiga (Sigma-Aldrich, St Louis, Mo) kerge isofluoraani anesteesia all. Mõnes katses nakatati hiiri intranasaalselt 50 ml RV-ga (5 3 106 TCID50) 24 tundi hiljem. Atsetaatravi annus oli 20 mM vastavalt meie eelmisele uuringule, kasutades sama lähenemisviisi.11 Atsetaatravi manustati intranasaalselt iga 24 tunni järel pärast nakatumist.

Kvantitatiivne reaalajas PCR

Kopsu kogu RNA (100 mg kopsukude) ja rakulüsaat ekstraheeriti, kasutades RNeasy Mini komplekti (Qiagen, Hilden, Saksamaa) vastavalt tootja juhistele. cDNA sünteesiti, kasutades juhuslikke heksameeri praimereid (OmniscriptRT komplekt, Qiagen). Esimese ahela cDNA-d kasutati IFN-b, IFN-l, Viperiini, MuC5AC (hiir ja inimene), OAS1, RIG-I (Ddx58), MAVS, MDA-5 (hiir) ja RV koopiate kvantifitseerimiseks, kasutades TaqMani testid praimerite ja sondidega, nagu varem teatatud.13 Absoluutseks kvantifitseerimiseks normaliseeriti iga geen 18s rRNA tasemele ja huvipakkuva geeni täpsed koopiad arvutati plasmiidse DNA amplifikatsioonil genereeritud standardkõvera abil. Teise võimalusena kasutati geeniekspressiooni arvutamiseks 2-DDCt (fold-change). PCR tingimused järgisid TaqMan Universal PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass) protokolle. Geeniekspressiooni test viidi läbi, kasutades StepOne'i (Applied Biosystems, Waltham, Mass).

Bronhoalveolaarne loputusvedelik

Hiired surmati pentobarbitooni lahuse intraperitoneaalse üleannustamise teel ja hingetoru kanüüliti. Kopse pesti 3 korda steriilse PBS-ga. Bronhoalveolaarse loputuse (BAL) vedelikku tsentrifuugiti, supernatant koguti kaheahelalise DNA mõõtmiseks ja pelletid suspendeeriti rakkude koguarvu ja diferentsiaalloenduse jaoks. Rakkude diferentsiaalloendamiseks värviti tsütospiini slaidid MayGrunwald-Giemsaga ja loendusprotseduuri viis läbi kogenud uurija pimesi.

Kaheahelalise DNA mõõtmine

Kaheahelalist DNA-d mõõdeti BAL vedelikus, kasutades Quant-iT PicoGreen kaheahelalist DNA reagenti (Invitrogen, Carlsbad, California) vastavalt tootja protokollile.

Histoloogiline analüüs

Pärast BAL-i perfuseeriti kopse südame kaudu PBS-iga ja puhuti 4-protsendilise paraformaldehüüdiga ning seejärel fikseeriti vasak kops 24 tunniks 4-protsendilises paraformaldehüüdis. Seejärel sisestati tükid parafiiniplokkidesse ja lõigati 5- mm osadeks, värviti hematoksüliini ja eosiiniga. Põletikulist infiltraati mõõdeti mikromeetrites ja viidi läbi 10 mõõtmist, alustades bronhide või veresoonte epiteeli lõpust kuni põletikulise infiltraadi lõpuni, kasutades tarkvara Olympus CellSens Standard (Olympus Corporation, Tokyo, Jaapan). Kogu loendamine viidi läbi katsetingimuste suhtes pimesi.

Voolutsütomeetria

Rakud eraldati kopsust PBS-i perfusiooniga ja seejärel digereeriti RPMI 1640 söötmes, millele oli lisatud 1 mg/ml kollagenaas IV (Invitrogen-Gibco, Waltham, Mass). Kopsudest ja BAL-ist eraldatud rakke inkubeeriti hiire Fc Blockiga (#553141 BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) 20 minutit. Rakke pesti ja värviti pinnaantikehadega anti-CD45 (1:200, #557235, kloon 30-F11, BD Biosciences). Intratsellulaarseks värvimiseks fikseeriti rakud tsütofiksiga/tsütoplasmaga (BD Biosciences) ja anti-RIG-I-ga (1:50, #35H2L48, ThermoFisher Scientific, Waltham, Mass) ning pärast inkubeerimist märgistati rakud sekundaarse antikehaga kitse küülikuvastase IgG-ga. H&L Cy{18}}konjugeeritud (1:1000, # ab97075, Abcam, Cambridge, Mass). Proovid saadi voolutsütomeetriga BD FACS Canto-II (BD Biosciences). Andmeid analüüsiti FlowJo tarkvaras (versioon 10, Tree Star, Inc, Ashland, Va).

In vitro uuringud epiteelirakuliinidel

Inimese BEC-d (BEAS-2B) ja inimese kopsuepiteelirakud (A549) osteti ettevõttest ATCC (Manassas, Va) ja neid kultiveeriti eelnevalt kirjeldatud viisil.13 Rakud külvati ükshaaval kontsentratsiooniga 1.5 3 105 rakud/mL 12-süvendplaatidel. Kakskümmend neli tundi pärast külvamist töödeldi rakke 400 mM naatriumatsetaadiga (Sigma-Aldrich) veel 24 tundi. Seejärel nakatati rakke RV-A1-ga (Multiplicity of Infection [MOI] 2) 1 tund, misjärel viirus eemaldati, rakke pesti ja lisati uus sööde, millele oli lisatud 5 protsenti FBS-i. Täiendav atsetaadiga töötlemine (400 mM) lisati kohe pärast nakatamist ja iga 24 tunni järel kuni rakkude kogumiseni.

Esmaste BEC-ide ja eetilise kinnituse kogumine

Terve mittesuitsetaja BEC-d koguti bronhoskoopia ajal bronhide harjamisel kirjaliku teadliku nõusolekuga. Kõik katsed viidi läbi Hunter New Englandi piirkonna tervishoiuteenuste eetikakomitee (05/08/10/3.09) ja Newcastle'i ülikooli ohutuskomitee (H-163-1205) heakskiidul.

BEC-de ja õhu-vedeliku liidese kultuuride tingimuslik ümberprogrammeerimine

BEC-d programmeeriti tinglikult ümber rho-seotud proteiinkinaasi inhibiitoriga (lõppkontsentratsioon 10mM) ja kombinatsioonis kiiritatud NIH-3T3 fibroblastidega monokihilistes kultuurides, nagu eelnevalt kirjeldatud.14,15 Tinglikult ümberprogrammeeritud sööde koosnes Dulbecco modifitseeritud Eagle sööde (kõrge glükoosisisaldusega 1 L-glutamiin) / Ham's F12 suhe 1:2, millele on lisatud 5 protsenti FCS-i, hüdrokortisooni (400 ng/ml), insuliini (5mg/ml), inimese rekombinantset epiteeli kasvufaktorit (10 ng). /mL), kooleratoksiin (8,4 ng/ml), adeniin (23,9 mg/mL) ja 0,2 protsenti penitsilliini-streptomütsiini.16 Laiendatud tinglikult ümberprogrammeeritud BEC-d võõrutati rho-seotud proteiinkinaasi inhibiitorist ja külvati {{24} }kaevu polüester transwell membraane ja diferentseeriti õhu-vedeliku liidesel (ALI) 25 päeva jooksul, nagu eelnevalt kirjeldatud.17 Katsed viidi läbi n 5 4 biotehnilise kordusega. Standardne Alcian sinine, pH 2,5 ja perioodiline happe-Schiffi värvimine viidi läbi 5- mm paksustel ALI lõikudel, et visualiseerida pseudostratifitseeritud epiteeli (vt joonist E1 selle artikli veebihoidlas aadressil www.jacionline.org).

SCFA ravi BEC kultuuris

Enne nakatamist töödeldi ALI kultuure põhiliselt 100, 400 või 1600 mM atsetaadi, butüraadiga. või propionaadi 24 tundi 600 ml ALI lõppsöötmes, mis koosneb bronhide epiteeli baassöötmest ja Dulbecco modifitseeritud Eagle söötmest (suhe 50:50), mis sisaldab hüdrokortisooni (0,1 protsenti) , veise insuliin (0,1 protsenti), epinefriin (0,1 protsenti), transferriin (0,1 protsenti), veise hüpofüüsi ekstrakt (0,4 protsenti) ja etanoolamiin (80 mM), MgCl2 (0,3 mM), MgSO4 (0,4 mM), BSA (0,5 mg). /mL), amfoteritsiin B (250 mg/ml), all-trans-retinoehape (30 ng/ml), penitsilliin/streptomütsiin (2 protsenti) ja inimese rekombinantne epiteeli kasvufaktor (0,5 ng/ml). Nakatumise päeval asendati basaalsöötme uue ALI lõppsöötme ja SCFA-raviga, mis jäeti lõpp-punkti analüüsini.

RV-nakkus ja proovide võtmine

ALI-BEC kultuurid nakatati apikaalselt RV-A1-ga. Algselt lahjendati RV-A1 põhilahust, et saada MOI väärtus 0,1, ja lisati kultuuride apikaalsele pinnale 2 tunniks 50 ml bronhide epiteeli alussöötmes koos toidulisanditega, 1% insuliini- transferriin-seleen ja 0,5 protsenti linoolhapet. Seejärel asendati nakkussööde ülejäänud katse ajaks 500 ml värske bronhide epiteeli baassöötmega (koos toidulisanditega). Apikaalne pesu (100 ml PBS) ja baassöötme proovid koguti 8- ja 48- tundi pärast nakatumist ning neid säilitati temperatuuril 2808 °C. Rakke hoiti 350 ml RLT puhvris (Qiagen), mis sisaldas 1 protsenti 2- merkaptoetanooli, temperatuuril 2808 °C geeniekspressiooni analüüsiks RT-kvantitatiivse PCR abil (joonis E2, C).

Kooskõlas suurenenud viirusevastase immuunmõjuga vähendas atsetaat 48 tundi pärast nakatumist viiruse RNA koopiate arvu (joonis E2, D) ja elusviiruse koormust (joonis E2, E). BEAS2B rakkudes, BEC-liinis, täheldasime, et atsetaatravi suurendas IFNB1 mRNA ekspressiooni 8 tundi pärast nakatamist ja IFNL2 mRNA ekspressiooni 4 ja 8 tundi pärast nakatumist (joonis E2, F). Viperiini ekspressioonile ei olnud olulist mõju (joonis E2, F). Erinevalt A459 rakkudes täheldatud mõjust viiruskoormustele ei avaldanud atsetaat mingit mõju viiruse RNA-le ega TCID50 kvantifitseerimisele BEAS2B rakkudes (joonised E2, G ja H).

SCFA-ravi mõju viirusevastastele vastustele ALI-BEC-ga nakatunud kultuurides

Olles täheldanud atsetaadi võimendavat toimet kopsuepiteeli rakuliinides, püüdsime järgmisena hinnata toimeid primaarsete epiteelirakkude mudelis, mis on diferentseeritud ALI-s (eksperimentaalne süsteem, mis koondab tõesemalt in vivo rakke). Rakkude diferentseerumist ja morfoloogiat kinnitas pokaalrakkude moodustumine (perioodiline happe-Schiffi värvimine) (joonis E1).

Atsetaat suurendas märkimisväärselt IFNB1 ja IFNl2/3 (IL28) RV-ga nakatunud BEC-del võrreldes nakatamata rakkudega (joonised 3, B ja D), kuid võrreldes töötlemata RV-ga nakatunud rakkudega ei olnud erinevusi. Atsetaat kaldus vähendama viiruse RNA-d kas 8 või 48 tundi pärast nakatumist RV-A1-ga (joonis 3, A ja B). Arvestades, et atsetaadil oli vähem selgeid võimendavaid mõjusid I tüüpi IFN-i vastuste RV indutseerimisele primaarsetes diferentseeritud epiteelirakkudes, laiendasime oma uuringuid, et teha kindlaks, kas butüraadil või propionaadil oli märgatav toime. Butüraat ja propionaat suurendasid ka IFNb, IFNl2/3 (IL28) ja IFNl1 (IL29) geeniekspressiooni mRNA ekspressiooni võrreldes nakatamata rakkudega (joonis 3, F, G, H ja L). Ravi butüraadiga suurendas IFNB1, IL28 ja IL29 ekspressiooni 48 tundi pärast RV-ga nakatumist võrreldes töötlemata RV-ga nakatunud rakkudega, kuigi see toime ei olnud piisav viiruskoormuse mõjutamiseks (joonis 3, I, J, K, ja L). Me ei leidnud supresseerivat toimet RV-indutseeritud MUC5AC ekspressioonile SCFA-ravi mis tahes annuse korral (vt joonist E3, AC, selle artikli veebihoidlas aadressil www.jacionline.org). Need andmed näitavad kollektiivselt, et erinevalt hiirte ja inimese rakuliinide andmetest on SCFA-del piiratud mõju viirusevastasele immuunsusele diferentseeritud primaarsetes epiteelirakkudes.

SCFA-d ei mõjuta I tüüpi IFN-i vastuseid alveolaarsetes makrofaagides

Et uurida, kas atsetaadi ja/või teiste SCFA-de viirusevastane toime oli tingitud alveolaarsete makrofaagide modulatsioonist (peamine varajase reaktsiooniga rakk viirusnakkuste ajal ja I tüüpi IFN-i peamine allikas), hindasime SCFA manustamise mõju ex vivo. viirusevastased vastused RVA1-ga stimuleeritud makrofaagides. Leidsime, et SCFA manustamine ei avaldanud olulist mõju Ifnb1, Viperiini või OAS1 indutseerimisele RV poolt, mis näitab, et SCFA-de immuunsüsteemi tugevdav toime ei ilmne alveolaarsetele makrofaagidele avalduva mõju kaudu (vt joonis E4, AC, selle artikli veebis hoidla aadressil www.jacionline.org).

Hingamisteede kaudu manustatud SCFA suurendas IFN-b ja viirust tundvaid retseptoreid enne RV-nakkust

Täiendava mehaanilise ülevaate saamiseks viirusevastaste radade kohta, mis on seotud I tüüpi IFN-i võimendamisega SCFA-de poolt, uurisime järgnevalt nende ühendite mõju viirusevastaste radade tundlikele geenidele. Jällegi manustati intranasaalselt 3 SCFA-d (atsetaat, butüraat ja propionaat) kontsentratsioonis 20 mM 24 tunni jooksul (joonis 4, A). Me ei leidnud ühegi SCFA mõju tsütosoolse viiruse RNA anduri MDA5 või selle adaptermolekuli MAVS ekspressioonile (joonis 4, B ja C). Seevastu butüraadi manustamine (kuid mitte teiste SCFA-de) reguleeris RIGI mRNA ekspressiooni üles (joonis 4, D). Butüraadi võimendav toime RIG-I ekspressioonile leiti olevat spetsiifiliselt kopsuepiteeli/stroomarakkudes (CD452), vereloome immuunrakkudes (CD451) mõju ei täheldatud (joonis 4, EI). Need andmed näitasid ühiselt, et erinevad SCFA-d võivad kaasasündinud immuunsuse reguleerimiseks toimida spetsiifiliste viirusevastaste tuvastusradade kaudu.

ARUTELU

See uuring annab uue ülevaate mikroobsete metaboliitide otse hingamisteedesse manustamise võimalikust kasust, et suurendada kopsu kaasasündinud immuunsust. Toidukiudaineid ja soolestiku mikrobiotast pärinevaid SCFA-sid on pikka aega seostatud soodsa mõjuga kopsude tervisele. Randomiseeritud platseebokontrolliga uuring näitas, et prebiootikumide (kiudainete) kasutamine enneaegsetel imikutel hoidis ära RV-nakkuste esimesel eluaastal.20 Toidukiud on mitteseeditavad polüsahhariidid, mida saab mikroobse fermentatsiooniga lagundada SCFA-deks. Uuringud on samuti leidnud, et SCFA-d võivad moduleerida terve soolestiku mikrobiootat.21 Meie uuring rõhutab, et SCFA-de manustamine hingamisteedesse võib avaldada ka otsest kohalikku kasulikku mõju peremeesorganismi reaktsioonidele. Oleme tuvastanud erineva mehhanismi toitumisest vahendatud mõjudest mikrobiootale, mis hõlmab kaasasündinud viirusevastase immuunsuse otsest pulmonaalset stimuleerimist SCFA-de poolt.

Meie andmed näitavad, et SCFA atsetaadi manustamine suurendab viirusevastaste immuunmediaatorite põhiekspressiooni püsiseisundis. See sobib kontseptuaalselt atsetaadi rolliga kopsude ettevalmistamisel IFN-ide jõulisemaks varajaseks vabanemiseks. Seda toetasid meie järeldused, et atsetaadi manustamine suurendas ka IFN-ide ja ISG-de indutseerimist vastuseks RV-nakkusele hiirtel. Seda seostati viiruskoormuse vähenemisega ning põletikueelsete reaktsioonide ja lima tootmise hilisema pärssimisega. Kõiki neid mõjusid peetakse ägeda viirusinfektsiooni kontekstis kasulikuks. Meie andmed sobivad kokku kirjandusega, mis näitab, et atsetaat on seotud laiaulatusliku tervisega seotud kasu pakkumisega, nagu südamefunktsiooni parandamine, punaste vereliblede tekke suurendamine ja immuunmälu moodustumine.22 Lisaks on atsetaat seotud erinevate mõjude moduleerimisega. immuunvastuse funktsioonid23-25 ja hingamisteede haiguste kontrolli all hoidmine.

Uurisime ka atsetaadi manustamise mõju epiteeli RV infektsioonile, kuna see on viiruse esialgse replikatsiooni esmane koht. Me leidsime atsetaadi sarnase viirusevastast võimendavat toimet inimese kopsurakuliinides, kusjuures A549 rakkudes täheldati tugevamat toimet kui BEAS-2B-rakkudes (mis teadaolevalt ekspresseerivad kõrgemaid IFN-i ja ISG-de baastasemeid).27 ,28 See võib osaliselt selgitada, miks atsetaadiga töötlemisel oli BEAS-2B-rakkudele väiksem mõju. Seevastu täheldasime, et inimese primaarsetes diferentseeritud BEC-des (ALI-BEC-des) ei olnud atsetaadil selget mõju I tüüpi IFN-i reaktsioonidele RV-le. Lisaks hindasime ka atsetaadi ja teiste SCFA-de võimet moduleerida I tüüpi IFN vastuseid alveolaarsetes makrofaagides, mida kultiveeriti ex vivo, ja sarnaselt ei leitud mingit mõju. See lahknevus in vivo ja in vitro leidude vahel võib viidata sellele, et mitu rakutüüpi ja raku-raku side võivad olla vastutavad in vivo täheldatud selge fenotüübi eest, kusjuures isoleeritud rakkude SCFA-dega töötlemisel täheldatakse vähem tugevat toimet.

Kuigi meie uuringu peamine eesmärk oli hinnata SCFA mõju kaasasündinud viirusevastasele immuunsusele, on mõeldav, et adaptiivsetele immuunvastustele võivad ilmneda allavoolu mõjud ning tulevased uuringud võivad keskenduda võimalikele mõjudele T- ja B-lümfotsüütide populatsioonidele ja tootmisele. neutraliseerivatest antikehadest.

Samuti tuleb märkida, et meie kasutatud hiiremudel on selline, kus toimub suhteliselt piiratud (;{0}} tundi) viiruse replikatsioon, kuigi kõik mõõdetud lõpp-punktid sõltuvad replikatsioonist.12,29 Täiendavad uuringud, kasutades hiirega kohandatud viirustüvesid. kui viiruse paljunemine toimub püsivamalt, võib sellel olla sügavam ja püsivam mõju. Lisaks viidi meie katsed läbi ainult emaste hiirtega ja edasised uuringud peaksid kinnitama, kas isastel esineb sarnaseid toimeid.

Kuigi atsetaadil oli ALI-BEC-des piiratud toime, täheldasime, et butüraadi manustamine võib suurendada I tüüpi IFN-vastuste RV indutseerimist. Need andmed on vastuolus Chemudupati jt uuringuga,30 mis näitas butüraadi pärssivat toimet I tüüpi IFN-i vastustele. Selles uuringus kasutati aga palju kõrgemaid butüraadi kontsentratsioone ja keskenduti ka erinevatele hingamisteede viirustele.

Lima tootmine kopsudes on iseloomulik RV-infektsioonile, mis põhjustab astma ja KOK-i kliinilise raskuse suurenemist ja ägenemist31,32, eriti MUC5AC-i hingamisteede põletiku suurenemise tõttu.33 Näitasime, et atsetaatravi vähendas kopsude Muc5AC ekspressiooni 4. ja 4. päeval. 6 pärast nakatumist. Sellest tulenevalt on näidatud, et SCFA-d nõrgendavad lima tootmist kopsudes gripiinfektsiooni34 ja allergilise hingamisteede põletiku ajal. 34, 35 Kuid ALI-BEC rakkudes ei moduleerinud atsetaat Muc5AC geeniekspressiooni, kuigi tuleb märkida, et hilisemad ajapunktid olid ei uuritud. Meie tähelepanek mutsiini ekspressiooni vähenemise kohta atsetaadiga töödeldud ja viirusega nakatunud hiirtel on kooskõlas meie varasemate leidudega, et I tüüpi IFN reguleerib negatiivselt peamise hingamisteede mutsiini Muc5ac ekspressiooni viirusnakkuse ajal.14 Molekulaarsed mehhanismid, mille kaudu see toimub, on ebaselged. , kuigi varasemad tõendid näitavad, et IL-13-vahendatud 2. tüüpi põletik võib olla oluline MUC5AC esilekutsumisel.36,37 Edasised uuringud peaksid püüdma põhjalikumalt mõista, kuidas atsetaat võib mõjutada hingamisteede lima tootmist.

Et uurida molekulaarseid mehhanisme, mille kaudu SCFA-d indutseerivad IFN-i, mõõtsime lisaks viirusevastaste radade tuvastamise geenide ekspressiooni. Me täheldasime, et butüraat ja vähemal määral atsetaat võivad indutseerida RIG-I ekspressiooni naiivsete hiirte kopsuepiteelirakkudes. Meie andmed viitavad sellele, et need SCFA-d suurendavad viiruse tuvastamise vastust, valmistades kopse ette suurendatud kaasasündinud vastuseks viirusinfektsioonile.

Nii astma kui ka KOK-i korral on hingamisteede epiteelirakkudes näidatud ex vivo I tüüpi IFN-i tootmist RV-nakkuse korral.38,39 On oletatud, et see defekt suurendab nendel isikutel vastuvõtlikkust viirusest põhjustatud ägenemiste suhtes. Neid defekte põhjustavad mehhanismid ei ole teada. Vaja on täiendavat tööd loommudelite või haigete rakukultuurisüsteemidega, et teha kindlaks, kas astma ja KOK-i korral täheldatud mikroobne düsbioos põhjustab atsetaadi või muude SCFA-de suhtelist defitsiiti, mida saab korrigeerida manustamisega, et taastada kahjustatud viirusevastane immuunsus.

Kokkuvõttes on SCFA-de kasutamine RV-nakkuse ravis seotud I ja III tüüpi IFN-i tootmise suurenemisega, mis on kopsu viirusevastase immuunvastuse kesksed komponendid. See uuring rõhutab, et mikroobsete metaboliitide, näiteks SCFA-de manustamine hingamisteedesse võib avaldada kasulikku mõju viirusevastasele immuunsusele ja võib potentsiaalselt leevendada hingamisteede viirushaiguste raskusastet.

VIITED

1. Trompette A, Gollwitzer ES, Yadava K, Sichelstiel AK, Sprenger N, Ngom-Bru C jt. Toidukiudude soolestiku mikrobiota metabolism mõjutab allergilisi hingamisteede haigusi ja vereloomet. Nat Med 2014;20:159-66.

2. Thorburn AN, McKenzie CI, Shen S, Stanley D, Macia L, Mason LJ jt. Tõendid selle kohta, et astma on arengust tingitud haigus, mida mõjutavad ema toitumine ja bakteriaalsed metaboliidid. Nat Commun 2015;6:7320.

3. Rivera-Chavez F, Zhang LF, Faber F, Lopez CA, Byndloss MX, Olsan EE jt. Butüraati tootvate klostriidide ammendumine soolestiku mikrobiotast põhjustab salmonella aeroobset luminaalset laienemist. Peremeesraku mikroob 2016;19:443-54.

4. Fachi JL, Secca C, Rodrigues PB, Mato FCP, Di Luccia B, Felipe JS jt. Atsetaat koordineerib neutrofiilide ja ILC3 vastuseid C. difficile vastu FFAR2 kaudu. J Exp Med 2020;217:jem.20190489.

5. Antunes KH, Fachi JL, de Paula R, da Silva EF, Pral LP, Dos Santos AA jt. Mikrobiootast pärinev atsetaat kaitseb respiratoorse süntsütiaalviiruse infektsiooni eest GPR43-tüüp 1 interferooni vastuse kaudu. Nat Commun 2019;10:3273.

6. Correa-Oliveira R, Fachi JL, Vieira A, Sato FT, Vinolo MA. Immuunrakkude funktsiooni reguleerimine lühikese ahelaga rasvhapetega. Clin Transl Immunol 2016;5:e73.

7. Koh A, De Vadder F, Kovatcheva-Datchary P, Backhed F. Toidukiududest peremeesorganismi füsioloogiani: lühikese ahelaga rasvhapped kui peamised bakteriaalsed metaboliidid. Cell 2016;165: 1332-45.

8. Sulaiman I, Wu BG, Li Y, Tsay JC, Sauthoff M, Scott AS jt. Funktsionaalne alumiste hingamisteede genoomne mikrobioomi profileerimine aktiivse mikroobide metabolismi hõivamiseks. Eur Respir J 2021;58:2003434.

9. Glanville N, Johnston SL. Ristserotüübi rinoviiruse vaktsiini väljatöötamise väljakutsed. Curr Opin Virol 2015;11:83-8.

10. Spacova I, De Boeck I, Bron PA, Delputte P, Lebeer S. Paiksed mikroobsed ravimid hingamisteede viirusnakkuste vastu. Trends Mol Med 2021;27:538-53.

11. Antunes KH, Stein RT, Franceschina C, da Silva EF, de Freitas DN, Silveira J jt. Lühikese ahelaga rasvhappeatsetaat käivitab respiratoorse süntsütiaalviiruse bronhioliidiga imikute rakkudes RIG-I vahendatud viirusevastase vastuse. EBioMedicine 2022;77: 103891.

12. Bartlett NW, Walton RP, Edwards MR, Aniscenko J, Caramori G, Zhu J jt. Rinoviirusest põhjustatud haiguse ja allergilise hingamisteede põletiku ägenemise hiiremudelid. Nat Med 2008;14:199-204.

13. Singanayagam A, Glanville N, Girkin JL, Ching YM, Marcellini A, Porter JD jt. Viirusevastase immuunsuse kortikosteroidide pärssimine suurendab KOK-i ägenemiste korral bakterite hulka ja lima tootmist. Nat Commun 2018;9:2229.

14. Gentzsch M, Boyles SE, Cheluvaraju C, Chaudhry IG, Quinney NL, Cho C jt. Tinglikult ümberprogrammeeritud tsüstilise fibroosi bronhide epiteelirakkude farmakoloogiline päästmine. Am J Respir Cell Mol Biol 2017;56:568-74.

15. Liu X, Ory V, Chapman S, Yuan H, albanese C, Kallakury B jt. ROCK-i inhibiitor- ja toiterakud kutsuvad esile epiteelirakkude tingimusliku ümberprogrammeerimise. Am J Pathol 2012;180:599-607.

For more information:1950477648nn@gmail.com