Naha äge kokkupuude ultraviolettkiirgusega kutsub esile neutrofiilide poolt vahendatud neerupõletiku

Meie ja teised oleme näidanud, et UV-valgus kutsub esile neutrofiilide kiire infiltratsiooni nahka (6, 7). Kuigi neutrofiilid soodustavad peamiselt põletikku kohalikes vigastuskohtades, on hiljuti tõdetud, et neutrofiilid võivad asuda ka elunditele, mis on eemal esmasest põletikukohast (8–10), kus nad aitavad kaasa kopsukoe vigastustele reaktiivse hapniku tootmise kaudu. liigid (ROS) (11) või aktiveerivad adaptiivset immuunsüsteemi lümfisõlmedes ja luuüdis (9, 12). SLE puhul arvatakse, et neutrofiilid mängivad olulist rolli nii lokaalsete kui ka süsteemsete haiguste korral. Neutrofiilid esinevad SLE-ga patsientide nahakahjustustes (13, 14) janeerudLN-ga patsientide kude (15, 16). Neutrofiilide geenisignatuuri kõrge ekspressioon on aktiivse haiguse, sealhulgas LN ja nahapõletike tugev ennustaja (17, 18). Põletikueelsed madala tihedusega granulotsüüdid (LDG) on suurenenud eriti nahahaigusega patsientidel (19). Kuigi need leiud viitavad neutrofiilidele lokaalses koekahjustuses SLE-s, siis kas neutrofiilid moodustavad patogeense seose nahapõletiku janeerukahjustusei mõisteta.

Et selgitada, kuidas naha kokkupuude UV-valgusega mõjutabneerudja neutrofiilide rolli nendes protsessides, hindasime muutusineeru-geeniekspressioon koos neutrofiilide migratsiooniga. Leidsime, et naha äge kokkupuude UV-kiirgusega stimuleerib põletikulisi protsesseneerud,kaasa arvatud endoteeli adhesioonimolekulide, põletikumediaatorite, vigastusmarkerite ja mööduva proteinuuria ekspressioon. Eelkõige leidsime, et neutrofiilid migreerusidneerudpärast kokkupuudet UV-valgusega IL-17A-sõltuval viisil, lokaliseerudes tubulointerstitsiaalsetesse (TI) piirkondadesse, kus neil esinesid põletikueelsed fenotüübid. Neutrofiilide kaubitsemise blokeerimine anti-G-CSF immunoglobuliini (IgG) raviga tühistatineeru-põletik ja takistas torukujuliste vigastuste markerite ülesreguleerimist. Need leiud näitavad koos, et naha kokkupuude UV-valgusega kutsub esile subkliiniliseneeru-neutrofiilide poolt vahendatud põletikulised ja vigastusprotsessid.

Tulemused

Naha kokkupuude UV-valgusega põhjustab subkliinilisi neerukahjustusi.Päikesevalgusega kokkupuudet on seostatud süsteemsete sümptomite süvenemisega ja haiguse ägenemise esinemisega SLE-ga patsientidel, sealhulgas nefriidiga (2–4). Seetõttu küsisime esmalt, kas äge steriilne nahapõletik, mille vallandab ühekordne kokkupuude ultraviolettkiirgusega B (UVB) valgusega (500 mJ/cm2) mustadel 6 (B6) hiirtel, põhjustab muutusineerud, sealhulgas põletik, vigastus ja proteinuuria (joonis 1A). Kontrollorganiks valiti kops, kuna SLE puhul ei ole valgustundlikkuse ja kliinilise kopsuhaiguse vahel teatatud. Kokku 500 mJ/cm2 UVB-valgust B6 hiirtel on määratletud kahe minimaalse erütematoosse doosina (20), mis on võrdlusdoos, mida kasutatakse inimeste protestimiseks (21). Perfuseeritud geeniekspressiooni analüüsidneerud tissues (Fig. 1A) revealed up-regulation in the gene expression of adhesion molecules vcam- 1 and e-selectin on days 1 and 2 after UVB light exposure (Fig. 1 B and C). In contrast, vcam-1 and e-selectin expression demonstrated a downward trend in the lung (SI Appendix, Fig. S1). We also observed a >10-foldneeru-induktsioon s100A9-s, mis on seotud neutrofiilse vahendajaganeerukahjustus(22), samuti suurenenud s100A6 ekspressioon, kaltsiumi siduv valk, mis on seotud torukujulise vigastusega (23) (joonis 1 D ja E). Kui s100A9 induktsioon tuvastati kopsus, jäi s100A6 geeniekspressioon kopsus muutumatuks (SI lisa, joonis S1). Põletikuline reaktsioonneerudseostati ka il-1 ekspressiooni varajase suurenemisega (1. ja 2. päeval pärast UV-kiirgust), samas kui tnf või il-6 muutus minimaalselt või üldse mitte (joonis 1F). Il-1 ekspressiooni tuvastati kopsus alles 6 päeva pärast naha kokkupuudet UVB-valgusega (SI lisa, joonis S1). Cxcl12 ekspressiooni kiire indutseerimine, kemokiin, mida eritavad glomeruli ja torukesed ning mis on seotudneerukahjustus(24), leiti kaneerudkuid mitte kopsu (joonis 1G ja SI lisa, joonis S1). Seetõttu õhutavad UVB-valgusest põhjustatud nahakahjustused kiirestineeru-põletikueelsed protsessid, samas kui kopsudes täheldatakse vähem muutusi.

Lisaks põletikueelsele reaktsioonile, mida täheldatineerud,nii proteinuuria kui ka uriini albumiini/kreatiniini suhe suurenesid esimestel päevadel pärast naha kokkupuudet UVB-valgusega (joonis 1 H ja I). See kiire mõjuneerufunktsioonsellega kaasnes lipokaliini-2 ekspressiooni ülesreguleerimine janeerukahjustusmolekul 1 (kim-1) (joonis 1 J ja K), torukujulised markeridneerukahjustusmida täheldatakse ka LN-is (25, 26). Vaatamata proteinuuria mööduvale olemusele, väljendus needneerukahjustusmarkerid püsisid kuni 6. päevani (joonis 1 J ja K), mis võib-olla peegeldab koe paranemist.

UV-valgusest põhjustatud nahapõletik põhjustab neutrofiilide migratsiooni neerudesse.Et uurida, kas neutrofiilid osalevad süsteemses põletikulises vastuses UVB-valgusele, uurisime neutrofiilide akumuleerumise kineetikat UV-valgusega kiiritatud nahas ja põrnas,neerud,ja C57BL/6 J (B6) hiirte kopsud, tüvi, mis jäljendab kõige paremini naha muutusi UVB-valguses inimese nahas (joonis 2A) (27). Pärast naha akuutset kokkupuudet UVB-valgusega suurenes neutrofiilide arv nahas 24 tunni jooksul seitse korda ja püsis kõrgel 6 päeva võrreldes UV-eelse algtasemega (D-1) ​​(joonis 2B). Sellega kaasnes neutrofiilide arvu vähenemine luuüdis ja tsirkuleerivate vere neutrofiilide arvu viiekordne suurenemine päevadel 1 kuni 6 (joonis 2 C ja D). Huvitaval kombel suurenes samal ajaperioodil neutrofiilide arv põrnas, kopsus janeerud(Joonis 2 E–G ja SI lisa, joon. S2A). Täpne kineetika oli elunditeti erinev, saavutades haripunkti 1. päeval kopsudes ja 2. kuni 6. päevalneerudja põrn (joon. 2 E–G). Aastalneerud, neutrofiilid paiknevad enamasti tubulointerstitsiaalses piirkonnas, sealhulgas veresoonkonnas, nagu näitab neutrofiilide elastaasi (NE) värvumine trombotsüütide/endoteelirakkude adhesioonimolekuli -1 (PECAM-1/CD31) läheduses või sellega kolokaliseerunud ) (joonis 2H). Tüüpilised kujutised joonisel 2H näitavad neutrofiile interstitsiaalses veresoonkonnas või selle ümbruses (täisvalged nooled) ja interstitsiumis (täpikujulised valged nooled), aeg-ajalt leidub neutrofiile ka glomerulites (kollased nooled). Sarnane lokaliseerimine tuvastati Ly6G-vastase immunofluorestsentsi (IF) värvimisega (SI lisa, joonis S2B).

Et teha kindlaks, kas teised kaasasündinud immuunrakud näitasid neutrofiilidega sarnaseid lokaalseid ja süsteemseid vastuseid, uurisime monotsüütide (CD11b pluss Ly6C pluss Ly6G−) jaotust samadel ajahetkedel pärast UVB-valgusega kokkupuudet. Kuigi monotsüüte värvati ka nahka, tuvastati nahas vaid väike arv infiltreeruvaid monotsüüte.neerud6. päeval pärast UVB-kiirgust (~2--kordne versus ~105--kordne suurenemineneerudneutrofiilid) (joonis 2F ja SI lisa joonis, S3). Kopsus ega põrnas monotsüütide arvu suurenemist ei tuvastatud (SI lisa, joonis S3), mis viitab sellele, et süsteemne reaktsioon UV-kahjustusele oli neutrofiilide suhtes suhteliselt selektiivne.

Neutrofiilide infiltratsiooniga nahka kaasnesid histoloogilised muutused, sealhulgas varajane dermise põletik ja epidermise rakusurm (1. ja 2. päev), millele järgnes akantoosi ja hüperkeratoosi areng koos serotsellulaarse kooriku moodustumisega mõnel juhul (6. päev) (SI) Lisa, joon. S4). Eelkõige ei ilmnenud pärast UVB-valgusega kokkupuudet avatud nahakahjustusi, mis viitab sellele, et täheldatud immuunrakkude infiltratsioon toimus steriilsetes tingimustes, kuigi ei saa välistada muutunud naha mikrobioomi panust (20).

Üheskoos näitavad need leiud, et naha kokkupuude ühe UVB-kiirguse annusega mobiliseerib neutrofiilid nii lokaalsesse põletikukohta kui ka siseorganitesse, sealhulgasneerud,millega kaasneb vere neutrofiilia. Kui üldised rändemustrid olid nii isas- kui ka emastel hiirtel sarnased, oli neutrofiilide nahasse infiltreerumine emastel kiirem kui isastel (joonis 2B). Seevastu lindi eemaldamisega tekkinud epidermise vigastus ei põhjustanud neutrofiilide migratsioonineerudvaatamata neutrofiilide infiltratsiooni ja põletikulise reaktsiooni ning koekahjustuste samale tasemele, nagu on näha UV-valgusega kokkupuutel (SI lisa, joonis S5), mis näitab, et süsteemne neutrofiilide levik ei ole kõigi steriilsete nahakahjustuste vormide puhul tavaline.

CISTANCHE PARANDAB NEERU-/NEERUHAIGUST

IL-17A soodustab neutrofiilide värbamist pärast naha kokkupuudet UV-valgusega.Naha kemotaktiliste ja põletikuliste vahendajate uuring näitas neutrofiilide kemokiinide ja põletikuliste tsütokiinide cxcl1, cxcl5/6, g-csf ja il-1 1 geeniekspressiooni olulist ülesreguleerimist kuni 2 päeva pärast UV-kiirgust (joonis fig. 3 A–D). S100A9 ekspressiooni kiire ja püsiv tõus ühtis neutrofiilide nahka infiltratsiooni kineetikaga (joonis 2B ja SI lisa, joonis S6), samas kui tsütokiinid il-6, tnf ja il-33 olid mööduvalt suurenenud ja naasid ekspressiooni algtasemele 6. päevaks (SI lisa, joonis S6). Seevastu il-36a tõusis ainult 6. päeval (SI lisa, joonis S6), mis võib-olla peegeldab reparatiivset funktsiooni. Monotsüütide mööduv (1 kuni 2 päeva) esinemine nahas (SI lisa, joonis S3) oli paralleelne monotsüütide-spetsiifiliste kemokiinide ccl4 ja ccl2 (SI lisa, joonis S6) ülesreguleerimisega. Sarnaselt neutrofiilide kogunemisele emaste hiirte nahka (joonis 2B), toimus monotsüütide akumuleerumine nahas ka emastel varem kui isastel (SI lisa, joonis S3).

UV skin exposure was accompanied by rapid (6 h) 12-fold induction in il-17a gene expression in the skin (Fig. 3E) as well as >1,000--kordne naha induktsioon g-csf ekspressioonis 1. ja 2. päeval pärast UV-kiirgust (joonis 3C). Et teha kindlaks, kas nende tsütokiinide indutseerimine oli neutrofiilide mobilisatsiooni seisukohalt oluline, kvantifitseerisime esmalt tsütokiini valgu kontsentratsiooni veres, mis näitas plasmakontsentratsiooni tugevat ja püsivat (10- kuni 100- korda) tõusu. IL-17A 6–24 tundi pärast kokkupuudet UV-valgusega (joonis 3F) koos IL-6 ja IL-12 tsütokiinide mööduva (piik 6 tunni pärast) suurenemisega, mis võib olla IL-17A-st (28) allavoolu (joonis 3 G ja H). IFN, GM-CSF, TNF, IL-10, IL-27, IL-23 ega IL1 plasmakontsentratsiooni tõusu ei täheldatud. Et teha kindlaks, kas IL-17A on vajalik UVB-indutseeritud neutrofiilide värbamiseks, blokeerisime IL-17A mõju neutraliseeriva antikehaga enne UV-kiirgusega kokkupuudet (joonis 3I). Anti-IL-17A IgG summutas märkimisväärselt vere neutrofiiliat (joonis 3J) ja nõrgendas neutrofiilide sissevoolu nii avatud nahakoesse (joonis 3K ja SI lisa, joonis S7A) kui kaneerud(joonis 3L ja SI lisa, joonis S7B). Need leiud näitavad, et neutrofiilide värbamine vastuseks UV-valgusele on vähemalt osaliselt vahendatud IL-17A poolt.

Neutrofiilid vahendavad neerupõletikku pärast naha kokkupuudet UV-kiirgusegaValgus.Et teha kindlaks, kas neutrofiilid olid vastutavad põletikuliste muutuste eestneerud following skin UVB light exposure, we blocked neutrophil recruitment prior to UV light exposure. Since cutaneous g-csf expression was up-regulated >1,000- korda pärast UV-kiirgust, mis viitab G-CSF-i kemotaktilisele rollile neutrofiilide värbamisel vastusena UV-valgusele, inhibeerisime neutrofiilide mobilisatsiooni luuüdist, blokeerides G-CSF-i, nagu on näidatud joonisel 4A. G-CSF-i neutraliseerimine hoidis ära vere neutrofiilia ja neutrofiilide värbamiseneerudpärast naha kokkupuudet UVB-valgusega (joonis 4 B ja C). Nagu varem erinevates mudelites (29, 30) kirjeldatud, ei muutnud G-CSF blokeerimine monotsüütide arvuneerud(joonis 4D). Vähenenud neutrofiilide migratsioonneerudsellega kaasnes märkimisväärne vähenemineneeru-adhesioonimolekulide vcam-1 ja e-selektiini (joonis 4 E ja F) ning põletikumediaatorite s100A9 ja il-1 1 d ekspressioon pärast UVB-kiirgust (joonis 4 G ja H). Lisaks on koekahjustuse markerid lipokaliini-2 ja kim-1neerudvähenes oluliselt G-CSF-i blokeeriva antikehaga ravitud hiirtel, keda raviti UV-valgusega, võrreldes isotüübiga töödeldud UV-kiirgusega eksponeeritud loomadega (joonis 4 I ja J). Nagu me varem teatasime (6), vallandas äge naha kokkupuude UVB-valgusega I tüüpi interferooni vastuseneerud(joonis 4K). G-CSF blokeerimine vähendas oluliselt, kuid ei tühistanud täielikult IFN skoori (joonis 4K). Kuigi neutrofiilide esinemineneerudoli vajalik ägedate põletiku- ja vigastusreaktsioonide jaoks, mida täheldati 1 päev pärast kokkupuudet naha UV-valgusega (joonis 4), sel ajahetkel ei täheldatud proteinuuria erinevusi, kuna proteinuuria maksimum tekkis umbes 4. päeval pärast UV-kiirgusega kokkupuudet (joonis 1 H ja I). Need andmed näitavad koos, et neutrofiilid vastutavad põletikulise vastuse eest ja aitavad otseselt või kaudselt kaasa I tüüpi interferooni indutseerimisele veres.neerudpärast naha kokkupuudet UV-kiirgusega. Sarnaselt anti-G-CSF IgG tulemustele pärssis neutraliseeriva anti-IL-17 antikeha manustamine osaliselt neutrofiilide migratsioonineerudja põhjustas geeniekspressiooni vähenemistneerudpõletikuliste (vcam-1 ja s100A9) ja vigastuste markerite (lipokaliin-2 ja kim-1), kuigi statistiliselt oli oluline ainult kim-1 ekspressiooni vähenemine (SI lisa, joonis 1). . S7 C–F)

Neerude neutrofiilide alampopulatsioon on pöördtransmigreeritud, fenotüüpi tuvastatakse ka SLE-patsientide veres.Kuigi pikka aega on eeldatud, et infektsiooni või steriilse põletiku kohtadesse sisenevad neutrofiilid läbivad seejärel apoptoosi ja makrofaagid eemaldavad need kiiresti, on mitmed uuringud näidanud, et mõned neutrofiilid liiguvad kahesuunaliselt, st pärast koesse sisenemist nad migreeruvad. tagasi vereringesse ja imbuvad teise kohta, seda protsessi nimetatakse pöördtransmigratsiooniks (rTEM) (8, 10, 11, 31–34). Et uurida, kas neutrofiilid, mis kodunesidneerudpärast naha kokkupuudet UVB-valgusega, mis kandis läbi avatud naha, uurisime neutrofiilide migratsiooni fotoaktiveeritavas B6 hiiremudelis (inimese ubikvitiin C [UBC]-fotoaktiveeritud [PA]-roheline fluorestsentsvalk [GFP]).

Katseskeem on illustreeritud joonisel fig 5A; 1 päev pärast naha kokkupuudet ühe UVB-kiirguse annusega eksponeeriti nahk violetse valgusega (405 nm), nii et infiltreeruvad immuunrakud fotokonverteeriti GFP-positiivseteks rakkudeks. Seejärel kvantifitseeriti fotokonverteeritud neutrofiilid (GFP pluss Ly6G plus ) perfusioonisneerudjärgmisel päeval. Voolutsütomeetria analüüs näitas, et umbes 20 protsenti neerudesse infiltreeruvatest neutrofiilidest olid pärast taustsignaali (∼ 10 protsenti) lahutamist GFP-positiivsed (joonis 5B). Erinevalt steriilse põletiku mudelitest maksas või cremasteri lihastes (8, 10) ei tuvastanud me kopsus fotokonverteeritud neutrofiile, võib-olla seetõttu, et 2. päeval leiti kopsus vähe neutrofiile (joonis 2F). Et testida, kas GFP pluss neutrofiilidneerudUV-kiirgusega kokkupuutunud nahakoest ekstravaseeritud või intravaskulaarselt PA-d, võrdlesime GFP ja neutrofiilide arvu muutusi, mis saadineerudhiirtel, kelle UV-valgusega kokkupuutunud nahk oli päev hiljem PA violetse valgusega (I rühm), võrreldes hiirtega, kelle UV-valgusega kokkupuutunud nahk oli päev hiljem PA violetse valgusega (II rühm, diagramm SI lisas, joonis S8A). Kuigi rühmade vahel ringlevate neutrofiilide protsendimääras erinevusi ei olnud (SI lisa, joonis S8B), täheldati GFP pluss neutrofiilide suuremat suurenemistneerudhiirtel, kelle UV-kiirgusega kokkupuutunud nahk oli samuti PA (I rühm), võrreldes GFP pluss neutrofiilide suurenemise puudumisega hiirtel, kus mitte-UV-kiirgusega nahk oli PA (II rühm) (SI lisa, joonis S7B). II rühmas oli neutrofiilide arv sarnane GFP positiivsuse taustaga, mis on näha joonisel 5B (SI lisa, joonis S8B).

Kuigi GFP pluss on madalneerudneutrofiilid II rühmas viitasid sellele, et violetne valgus ei PA tsirkuleerivaid rakke UV-kiirgusega mitte kokku puutunud nahas, jäi võimalikuks, et kokkupuude UV-valgusega muutis neutrofiilide koostoimeid naha veresoontega, võimaldades suuremat fotokonversiooni ja sellele järgnevatneerudjuurdepääs. TEM-neutrofiilide suhtelise proportsiooni määramiseks kvantifitseerisime rTEM-i läbinud neutrofiilide iseloomustamiseks kasutatud pinnamarkerite ekspressiooni: CXCR4hi (8) ja ICAM1hiCXCR1lo (11, 35). Tõepoolest, GFP plussneerudneutrofiilid väljendasid kõrgemat CXCR4 taset võrreldes GFP pluss neutrofiilidega nahas või GFP- neutrofiilidega nahasneerud(Joonis 5C). of

huvi,neeru-CXCR4 ligandi cxcl12 ekspressioon 1–2 päeva pärast naha kokkupuudet UVB-valgusega oli samaaegne CXCR4hi neutrofiilide esinemisega veres.neerud(joonis 1G), mis võib anda kemotaktilise stiimuli nende neutrofiilide värbamiseks neerudesse. Huvitav on see, et tuvastasime luuüdis CXCR4hi ja ICAM1- hiCXCR1lo neutrofiilid hilja pärast UV-kiirgusega kokkupuudet (6. päev, SI lisa, joonised S9 B ja C), mis viitab sellele, et osa neist neutrofiilidest on samuti tagasi luuüdi sarnane sellega, mida on teatatud rTEM-i puhul pärast maksakahjustust või naha viirusinfektsiooni (12, 36). Kooskõlas nende tähelepanekutega tuvastasime 2. päeval pärast UV-kiirgusega kokkupuudet vere neutrofiilidel kõrgema CXCR4 ekspressiooni, mis võib-olla püüdis rakke teelneerudja luuüdi (SI lisa, joonis S9D). Samamoodi tuvastati GFP pluss neutrofiilide hulgas oluliselt suurem protsent ICAM1hiCXCR1lo rakke.neerudvõrreldes GFP pluss neutrofiilidega nahas ja GFP− neutrofiilidega nahasneerud(joonis 5D). ICAM1hiCXCR1lo fenotüüp tuvastati ∼ 20 kuni 35 protsendil GFP pluss neutrofiilidestneerud(joonis 5D), mis viitab sellele, et neutrofiilide alamhulk, mis migreeruvadneerudUV-kiirgusega kokkupuutuva naha kaudu teevad seda pöördtransmigratsiooni teel, ülejäänud osa aganeerudTõenäoliselt aktiveeruvad neutrofiilid, kui nad ringlevad läbi põletikulise UV-kiirgusega kokkupuutuva naha. ICAM1- hiCXCR1lo neutrofiilide alampopulatsioon tuvastati kaneerudtavalistest B6-hiirtest, kes olid kokku puutunud UV-valgusega, kes ei saanud PA-d (SI lisa, joonis S9A).

Kuigi nii CXCR4hi kui ka ICAM1hiCXCR1lo neutrofiilide fenotüüpe on erinevates hiiremudelites seostatud põletikuliste funktsioonide ja koekahjustustega (11, 31, 37), on nende rakupopulatsioonidega inimeste haiguste puhul läbi viidud vähe uuringuid. Arvestades neutrofiilide tärkavat rolli SLE-s (13, 17, 18) ja nende näilist heterogeensust (19), uurisime, kas SLE-ga patsientidel on normaalse tihedusega polümorfonukleaarsed rakud (PMN-id) või LDG-d.

demonstreeris vastupidiselt migreeruvaid fenotüüpe: CXCR4hi (37, 38) ja ICAM1hiCXCR1lo. PMN-ide ja LDG-de voolutsütomeetriline profileerimine näitas SLE-ga patsientidel nende rakkude pinnal kõrgemat CXCR4 ekspressiooni võrreldes tervete kontrollidega (joonised 6 A ja C). Lisaks leidsime SLE veres väikese, kuid oluliselt suurema ICAM1hiCXCR1lo PMN-ide protsendi (keskmine 3,5 protsenti) võrreldes tervete kontrollidega (keskmine 1,4 protsenti) (joonis 6B). Huvitav on see, et LDG neutrofiilide populatsioon (CD15 pluss CD14loCD10 pluss perifeerse vere mononukleaarsetes rakkudes [PBMC]) sisaldas suuremat protsenti ICAM1hiCXCR1lo rakke kui PMN-id nii terves (keskmine, 7,1 protsenti) kui ka SLE-veres (keskmine, 29,4 protsenti) 6 B ja D). RTEM-i sarnane populatsioon oli SLE-ga patsientide LDG-des oluliselt rohkem esindatud võrreldes tervete kontrollidega (joonis 6D). Need andmed tuvastavad rTEM-sarnaste neutrofiilide fenotüüpide olemasolu PMN-ides ja eriti LDG-des SLE-ga patsientidel.

Arutelu

Naha UV-kiirgusega kokkupuute süsteemsed mõjud on halvasti mõistetavad. Nende radade tuvastamine normaalsetes lähtetingimustes võib anda teada süsteemse kudede kaasamise mehhanismidest pärast päikese käes viibimist, mis esineb selliste haiguste puhul nagu SLE (2–4). Siin kirjeldame mitmeid leide selle kohta, kuidas päikesevalgus mõjutab neerusid. Esiteks näitasime, et naha äge kokkupuude UVB-valgusega põhjustab põletikulisi ja vigastusineerud,sealhulgas subkliiniline proteinuuria. Huvitaval kombel needneeru-muutustega kaasnes neutrofiilide infiltratsioon neerudesse pärast UVB-valguse poolt vahendatud nahapõletikku. Neutrofiilide vastus sõltus IL-17A-st ja G-CSF-ist. Neerude neutrofiilidel olid põletikueelsed fenotüübid, mida tõendab NE rakuväline lokaliseerimine, suurem osa rTEM-i (CXCR4hi), mida tuntakse ka kui "vananenud" ja ICAM1hiCXCR1lo rakke. Neutrofiilid olid otseselt seotud subkliiniliseganeerukahjustus,kuna neutrofiilide vähenemine põhjustas adhesioonimolekulide, põletikuliste tsütokiinide, IFN-I signatuuri ja neerukahjustuse markerite ekspressiooni märkimisväärse vähenemise pärast naha UV-kiirgust.

On teatatud, et muud tüüpi nahavigastused, nagu teibi eemaldamine ja TLR7 agonisti paikne manustamine, suurendavadneerukahjustusteatud luupuse mudelites, kuigi arvati, et haiguse intensiivistumist vahendavad pigem makrofaagid ja dendriitrakud, mitte neutrofiilid (39, 40). Olles näidanud, et lindi eemaldamine ei toonud kaasa neutrofiilide värbamistneerud, pakume välja, et kokkupuude UV-kiirgusega erineb teist tüüpi steriilsetest nahapõletikest. Seda võib seletada fotoproduktide või ainulaadsete põletikuliste vahendajate tekkega pärast UV-kahjustust, mis käivitavad neerud põletiku tekkeks, erinevustega neutrofiilide eemaldamises pärast UV-kiirgust võrreldes lindi eemaldamisega või muude teguritega. Täheldasime, et UV-valgus käivitas nahas il-17mesenger-RNA (mRNA) kiire ja tugeva indutseerimise koos kõrge tsirkuleeriva IL-17A valgu tasemega (~100-kordne tõus) , mis oli vajalik neutrofiilide värbamiseks pärast kokkupuudet UV-valgusega. Samaaegne 100- kuni 1,000--kordne induktsioon naha g-csf ekspressioonis viitab sellele, et IL-17A/G-CSF telg on tõenäoline mehhanism, mis vastutab neutrofiilia ja neutrofiilide kudede kodunemise eest vastuseks UV-valgusele. IL-17A roll granulopoeesi ja neutrofiilide värbamise reguleerimisel G-CSF indutseerimise kaudu on homöostaatilistes tingimustes hästi tunnustatud ja mõned uuringud on tuvastanud, et IL-17A on oluline neutrofiilide värbamisel steriilne põletik (41, 42). Luupuse korral on kõrgenenud IL-17A ekspressioon nahakahjustustes (43) ja tsirkuleeriva IL-17A taseme tõus on seostatud haiguse halvemate ilmingutega (44), kuigi spetsiifiline seos neutrofiilidega, selle haiguse patogeenset populatsiooni (13, 17, 18) ei ole veel uuritud. Lisaks otsesele mõjule G-CSF-vahendatud neutrofiilide mobilisatsioonile luuüdist, võib IL- 17A kaasa aidata ka neutrofiilide sisenemisele luuüdist.neerudstimuleerides adhesioonimolekulide (nt VCAM-1 ja E-Selectin) ekspressioonineeru-endoteel (45, 46).

Kasutades sama ägeda UV-kiirguse kokkupuute mudelit, teatasime hiljuti, et ühekordne UV-valguse annus kutsus esile lokaalse ja süsteemse IFN-I vastuse, mis oli vajalik neutrofiilide tõhusaks värbamiseks nahka (6). Kuna on näidatud, et IFN-I indutseerib IL-17A tootmist (47), on usutav, et need rajad viivad kas iseseisvalt või koosmõjus UV-valguse poolt vahendatud neutrofiilide värbamiseni ja migratsioonini, millest me siin arutame. Kuigi meie leiud viitavad IL- 17A põletikulisele rollile, on UVB-valguse pärssivat mõju IL-17A signaaliülekandele varem teatatud psoriaasi korral, kus psoriaatilise naha kokkupuude UVB-valgusega kõrvaldas patogeensed T-rakud ja müeloidsed põletikulised dendrirakud (48, 49). Kuna psoriaatiline nahk, erinevalt tervest, on rikas IL-i tootvate ja reageerivate T-rakkude poolest, määrab raku koostise erinevus tõenäoliselt vastuse UVB-valgusele, sealhulgas UVB-valguse poolt vahendatud IL-i pärssimise ulatuse. -17Retseptorekspressioon (50). UV-annus võib samuti määrata, kas ilmneb põletikuline või terapeutiline toime: väikeseid annuseid seostatakse põletikuvastaste ja immunosupressiivsete tagajärgedega (51), mis võib olla tingitud CD8 T-rakkude reaktsioonide inhibeerimisest (52).

Neutrofiilid mängivad kudede põletiku ajal mitut rolli. Kui neutrofiilid aktiveeritakse patogeeniga seotud molekulaarsete mustrite ja kahjustustega seotud molekulaarsete mustrite (DAMPS) või retseptorite seotuse tõttu, aitavad neutrofiilid otseselt kaasa kudede vigastustele, vabastades proteaase, ROS-i ja neutrofiilide ekstratsellulaarsete püüniste (NET) väljapressimist (53, 54). Neutrofiilid võivad samuti soodustada kudede paranemist rakujäätmete fagotsütoosi ja kudede revaskulariseerimise kaudu (8). SLE korral on neutrofiilide geenisignatuur aktiivse haiguse, sealhulgas LN ja naha luupuse tugev ennustaja (17, 18). Neutrofiile leidub nii nahakahjustustes (13, 14) kui kaneerudSLE patsientide biopsiaproovid (15, 16) ja nende põletikulised omadused on osaliselt tingitud NET moodustumisest (16). See protsess hõlmab suurenenud ROS-i tootmist (55), mitokondriaalset DNA vabanemist (55) ning põletikuliste valkude, nagu s100A9 (56), IL-1b (57) ja I tüüpi interferoonide (55) vabanemist ja esilekutsumist. , 58). Meie leiud, et neutrofiilide neerudesse migratsiooni pärssimine tühistas s100A9 ja vähendas oluliselt IL-1b ekspressiooni janeerudIFN-i skoor viitab sellele, et mängus võivad olla sarnased põletikulised funktsioonid. Seoses neeruhaigusega SLE korral lokaliseeruvad neutrofiilid peamiselt TI endoteelis, kus on suurenenud ekspressioon.neerukahjustusmarkerid kim-1 ja lipokaliini-2 LN-i neerukudedes (59,60). Proteinuuria võib tekkida glomerulaarbarjääri liigsest läbilaskvusest valkude suhtes, mis on tingitud valgu reabsorptsiooni kahjustusest torukestes või nende mehhanismide kombinatsioonist (61). TI-kahjustus SLE-ga patsientidel on sagedane patoloogiline leid LN-neerudes, sealhulgas kerge glomerulaarkahjustusega (61, 62). On näidatud, et TI-vigastus ennustab LN-i raskust (63, 64), kuid selle käivitavad mehhanismid pole teada. Kuna kõrgenenud kim{9}} ja lipokaliin-2 on SLE korral TI vigastuse tunnustatud markerid (26, 65) ja blokeerivad neutrofiilide migratsioonineerudinhibeeris nende ekspressiooni, pakume välja, et pärast UV-kiirgust täheldatud mööduv proteinuuria on neutrofiilide poolt vahendatud subkliinilise TI põletiku tagajärg (65). Suurenenud neeru vcam-1 ekspressioon, teine ​​TI-kahjustuse marker SLE-s (66), toetab seda mudelit veelgi.

Lisaks põletiku levikule steriilsete või nakkuslike vigastuste lokaalsetes kohtades on neutrofiilid koduks kaugetele elunditele (8–10), kus nad sõltuvalt kontekstist soodustavad koekahjustust ROS-i tootmise kaudu (11) või aktiveerivad. adaptiivne immuunsüsteem lümfisõlmedes ja luuüdis (9, 12). Nende neutrofiilide põletikulist olemust on seostatud nende võimega väljuda esmasest vigastuskohast ja migreeruda sekundaarsetesse kohtadesse, st läbida rTEM (9–11, 31–34). Meie järeldused, et GFP-d sisaldavate rakkude PA-d nahas pärast UV-kiirgust põhjustasid GFP ja neutrofiilide tuvastamiseneerudrTEM fenotüübiga viitavad sellele, et alampopulatsioonneeru-neutrofiilid migreerusid UV-kiirgusega kokkupuutuvalt nahalt tagasi (GFP pluss neutrofiilid moodustavad umbes 20 protsentineerudneutrofiilid ja neist 20 kuni 35 protsenti on rTEM; seetõttu moodustavad rTEM 4–7 protsenti koguarvustneerudneutrofiilid). See rTEM-i osakaal on võrreldav pärast steriilset maksakahjustust (∼9 protsenti) (36) ja isheemia-reperfusioonikahjustust (∼8 protsenti) (11) teatatud osakaaluga. Muudel asjaoludel on rTEM-id osutunud põletikueelseks (10, 11) ja kahjustanud apoptoosi (35), mis põhjustab võimaluse, et nad mängivad rolli UV-indutseeritud protsessis.neerukahjustus.Nende neutrofiilide suurenenud CXCR4 ekspressioon on kokkusattumusena eriti olulineneeru-Täheldati podotsüütide ja tuubulite poolt ekspresseeritud CXCR4 ligandi cxcl12 (24) ekspressiooni, mis tõenäoliselt annab sellele neutrofiilide populatsioonile kemotaktilise signaali. Suurenenud CXCR4 ekspressioon immuunrakkudes koos kõrge tasemeganeeru-CXCL12 on tuvastatud LN-ga SLE-ga patsientidel (67) ja see rada oli seotud luupuse ja isheemia-reperfusiooniganeerukahjustushiirtel (24, 68). Lisaks rTEM-i markerile on suurenenud CXCR4 ekspressioon ka "vananenud" neutrofiilide näitaja, mis võib vahendada kudesid kahjustavaid põletikulisi reaktsioone (38). CXCR4 täpne roll neutrofiilide värbamiselneerudsaab uurida CXCR4 antagonismi abil, nagu varem tehti teistes steriilsete vigastuste mudelites (38).

Koespetsiifiline neutrofiilide migratsioon ja mehhanismid, mis vastutavad adhesioonimolekulide erineva ekspressiooni eest erinevates organites, ei ole hästi teada (69). Kemokiini cxcl12 kõrgem ekspressioonitaseneerudkuid mitte kops ei suuda seletada CXCR4hi neutrofiilide eelistatud esinemist neerudes. Lisaks soodustab vcam-1 ja e-selektiini ekspressiooni esilekutsumine neerudes, võrreldes ekspressiooni mittemuutusega kopsudes, tõenäoliselt eelistatud neutrofiilide värbamisele ja säilimisele neerudes. S100A9 ekspressiooni 5- kuni 6-kordne suurenemine kopsus võrreldes 30- kuni 60-kordse suurenemisega neerudes ja 6-kordse suurenemisega il-1b ekspressioon kopsus võrreldes 16-kordse suurenemisega neerudes viitab veelgi kudede erinevustele põletikulises vastuses. Neutrofiilide infiltratsiooni vähenemist neerudes pärast G-CSF neutraliseerimist võib seostada nii tsirkuleerivate neutrofiilide arvu ja aktivatsiooni vähenemisega kui ka vcam{13}} ja e-selektiini lokaalse ekspressiooni vähenemisega. Siiski ei saa me olla kindlad, kas nende adhesioonimolekulide esialgne ülesreguleerimine pärast naha UV-kiirgust on tingitud nahast pärinevatest tsütokiinidest/DAMPS-idest või kas neutrofiilid aitavad seriinproteaaside vabanemise kaudu otseselt kaasa nende ekspressioonile, nagu on näidatud teistes kontekstis (70). Sõltumata mehhanismidest ja märkides, et me ei ole kõigi kudede kohta kõikehõlmavat analüüsi läbi viinud, annavad meie uuringud tõendeid teatud organite selektiivsuse kohta UV-valguse poolt vahendatud süsteemsetes mõjudes. Tulevased uuringud käsitlevad süsteemse neutrofiilide leviku koespetsiifilisi funktsionaalseid tagajärgi, näiteks vaskulaarse albumiini lekke ja turse moodustumise tõttu kopsudes (11, 36).

SLE-ga patsientidel on raske ühemõtteliselt seostada kokkupuudet naha UV-valgusega süsteemse haiguse ägenemisega, kuna erinevatel isikutel on nähtavad valgustundlikkusreaktsioonid märkimisväärselt erinevad (1 kuni 3 nädalat) (21). Lisaks subkliinilineneerukahjustusvõib kergesti vahele jääda, kuni järjestikune kokkupuude UV-valgusega suurendab mõju. Kuigi leidsime, et neutrofiilide vahendatudneerupõletikvastusena UV-valgusele ei põhjusta tervetel hiirtel kliinilisi haigusi, võib selline mehhanism mitmel viisil kaasa aidata LN-i ägenemisele valgustundlikel luupuse patsientidel. Fc-retseptorite seotus immuunkomplekside poolt võib suurendada neutrofiilide värbamist, mille tulemuseks on ROS-i ja proteaaside vabanemine (71); luupuse neutrofiilide ja LDG-de suurenenud võime toota NET-e, mis SLE-ga patsientidel ei eemaldata tõhusalt (72), võib viia kudesid kahjustavate proteaaside vabanemiseni (73) ja IFN-I vastuse levikuni (58) või otsene kahjuneerudendoteeli, tekitades veresoonte kahjustusi ja lekkeid (16). Veelgi enam, luupuse naha aluseks olevad erinevused, nagu tõhustatud IFN-I signaaliülekanne (5, 74) ja defektid kaitsvas Langerhansi rakupopulatsioonis (75), võivad teavitada neutrofiilide poolt vahendatud süsteemsete vastuste ulatust ja olemust. Neutrofiilide migratsiooni jälgimist koos autoantikehade küsitlemise, apoptootiliste rakkude kogunemise ja madala komplemendi tasemega saab käsitleda luupuse uudsete mudelite, näiteks geneetiliselt määratletud kolmikmutantide (Sle1.Mfge8−/− C1q−/− ja Sle1.Mfge8−) abil. /−C3−/−) (76) või muud luupuse tüved pärast kokkupuudet UV-valgusega.

Täpseid mehhanisme, mis seovad neutrofiilid põletikuga SLE-s, võivad lisaks mõjutada neutrofiilide/LDG fenotüüp, kuna heterogeensus nendes populatsioonides on muutunud ilmsemaks (77). Meie leiud kõrgenenud CXCR4 ja ICAM1hiCXCR1lo (rTEM) tsirkuleerivate populatsioonide kohta, eriti SLE LDG-de puhul, suurendavad seda heterogeensust veelgi ja viitavad sellele, et mõnel veres põletikuvastasemal granulotsüütidel võib olla eelnev kudede kogemus, st elukoht veres. kahjustatud elundikuded, näiteks nahk, enne süsteemset levikut. RTEM-i fenotüüpe on varem teatatud reumatoidartriidiga patsientide sünoviaalvedelikus ja tsirkuleerivates neutrofiilides (35, 78) ja ägeda pankreatiidiga seotud kopsukahjustuse korral (79). Nende roll SLE-s nõuab edasist uurimist.

CISTANCHE PARANDAB NEERU/NEERU VALU

Materjalid ja meetodid

Hiired.Kõik loomkatsed kiitis heaks Seattle'i Washingtoni ülikooli institutsionaalne loomade hooldamise ja kasutamise komitee. Esialgsed katsed viidi läbi nii isaste kui ka emaste C57BL/6J hiirtega (Jackson Laboratory, 3 kuni 4 kuud vanad, joonised 1 ja 2). Kõigis järgnevates katsetes kasutati emaseid hiiri. PA uuringud viidi läbi B6-ga. Cg-Ptprc Tg (UBC-PA-GFP) 1Mnz/J emased hiired (Jackson Laboratory, 3–4 kuud vanad). Need hiired genereeriti PAGFP-d (T203H varianti) kandva transgeense vektori süstimisega inimese ubikvitiini C promootori transkriptsiooni kontrolli all C57BL/6 embrüotesse. Loomi hoiti patogeenivabades tingimustes ja neid hoiti 12-tunnistes hele-pimeduse tsüklites, võimaldades ad libitum juurdepääsu toidule ja veele. Kõikide loomadega tehtud katsed viidi läbi samal kellaajal, et vältida ööpäevase rütmi mõju neutrofiilide migratsioonile (38).

Kokkupuude UVB valgusega ja lindi eemaldamine.Isaste ja emaste C57BL/6 hiirte seljaosa raseeriti vähemalt 24 tundi enne UVB-valgusega kiiritamist ja katsetes kasutati ainult pigmenteerimata nahaga hiiri. Hiired anesteseeriti isofluraaniga ja eksponeeriti ühe UVB-valguse annusega (500 mJ/cm2), kasutades FS40T12/UVB pirne (National Biological Corporation), mille maksimaalne emissioon oli vahemikus 300–315 nm. UVB valguse energiat seljapinnal mõõdeti fotovalguse IL1400A radiomeetriga, mis oli varustatud SEL240/UVB detektoriga (International Light Technologies). Hiired surmati 1, 2 või 6 päeva pärast UVB-valgusega kokkupuudet ja kontrollidena kasutati kiiritamata hiiri (D-1) (joonis 2A). Epidermaalse teibi eemaldamine viidi läbi vastavalt eelnevalt kirjeldatule (7) ning naha- janeerudhinnati 24 tundi pärast vigastust

IL-17A ja G-CSF inhibeerimine.Hiiri raviti intravenoosselt 100 ug puhastatud roti hiirevastase IL-17A IgG-ga (BioLegend) või isotüübikontrolliga 3 tundi enne kokkupuudet UV-valgusega (1 × 500 mJ/cm2) (joonis 3I). Neutrofiilide olemasolu veres, nahas ja soolalahusega perfuseeritudneerudkude hinnati voolutsütomeetria abil 24 tundi pärast UV-kiirgust, nagu allpool kirjeldatud. Neutrofiilide migratsiooni vastusena UV-valgusele inhibeeriti, töödeldes hiiri intraperitoneaalselt 50 ug hiirevastase G-CSF monoklonaalse antikehaga või hiire IgG isotüübi kontrolliga (R&D Systems) 24 tundi ja 3 tundi enne naha kokkupuudet UVB valgusega (1 × 500 mJ). /cm2) (joonis 4A). Pärast südame perfusiooni on neutrofiilide ja monotsüütide arv veresneerudhinnati voolutsütomeetria ja geeniekspressiooni abil qPCR abil, nagu allpool kirjeldatud. Täiendava kontrollrühmana kasutati hiiri, kes ei puutunud kokku UVB-valgusega.

Rakkude eraldamine erinevatest elunditest.Pärast eutanaasiat CO2 sissehingamisega eemaldati tükk seljanahast ja hoiti RPMI (Roswell Park Memorial Institute) lahuses jääl kuni töötlemiseni. Veri koguti südame punktsiooniga etüleendiamiintetraäädikhappega kaetud süstaldesse. Seejärel viidi läbi vasaku vatsakese kaudu pärast parema aatriumi lõikamist südame perfusioon, kasutades fosfaatpuhverdatud soolalahust (PBS) (∼ 60 ml). Edukas perfusioon määrati täieliku jälgimise teelneerudja kopsude kahvatus. Kopsud, neerud, põrn ja mõlemad reieluud eemaldati ettevaatlikult ja asetati RPMI lahusesse jääle kuni proovi töötlemiseni. Rakud eraldati samaväärsetest nahakoe piirkondadest (~30 mm2), hakkides ja seedides kude 0,28 ühikut/ml Liberase TM-iga (Roche) ja 0,1 mg/ml desoksüribonukleaas I-ga ( Worthington) PBS-s koos Ca pluss 2 ja Mg pluss 2 sisaldusega 60 minutit 37 kraadi juures loksutades. Rakud eraldati ühestneerudlooma kohta;neerudkuded peeneks ja seediti 2 mg/ml I tüüpi kollagenaasis (Worthington) 30 minutit 37 kraadi juures vastavalt avaldatud protokollile. Kopsurakud koguti seedides kudet PBS-is (Ca pluss 2 ja Mg pluss 2) 1 mg/ml kollagenaasi tüüp 1 ja 60 U desoksüribonukleaas I-ga. Terved põrnad purustati 40 μm rakusõelal ja pesti RPMI lahusega. Täisverd ja põrna, luuüdi, neerude ja kopsude rakke töödeldi 1X punaste vereliblede (RBC) lüüsipuhvriga (BD Biosciences). Pärast isoleerimist / seedimist filtreeriti kõigi kudede rakud (40 μm), pesti PBS-ga ja suspendeeriti enne loendamist uuesti RPMI lahuses.

Voolutsütomeetria värvimine ja analüüs.Rakke töödeldi Fc Block TruStain FcX-ga (Biolegend) ja värviti värviga Zombie Aqua Viability (Biolegend) vastavalt müüja soovitustele. Rakud pesti ja pinnavärvimine viidi läbi, kasutades Biolegendilt ostetud hiirespetsiifilisi fluorestseeruvaid antikehi. Elusate immuunrakkude (Zombie Aqua-CD45 plus) väravas analüüsiti erinevaid müeloidrakkude populatsioone. Kvantifitseeriti neutrofiilide (Ly6CintLy6Ghi) ja monotsüütide (Ly6C pluss Ly6G−) protsent ja arv. Tüüpiline voolutsütomeetria värav on esitatud SI lisas, joonisel S10. Pinnamarkerite ekspressiooniprotsent ja keskmine fluorestsentsi intensiivsus PA mudelis (CXCR4, ICAM1 ja CXCR1) määrati, kasutades fluorestsentsi miinus üks (FMO) värvimiskontrolle neutrofiilide väravas (Ly6Ghi). Kõiki proove töödeldi CytoFLEX voolutsütomeetriga (Beckman Coulter) ja andmeid analüüsiti FlowJo tarkvara versiooniga 10 (Tree Star).

Fotoaktiveerimise (PA) uuringud.UBC-PA-GFP hiired raseeriti ja osa seljast kiiritati ühe annuse UVB-valgusega (500 mJ/cm2), nagu eespool kirjeldatud. UVB-valgusega eksponeeriti ainult fotokonverteeritav nahapiirkond, ülejäänud nahk kaeti alumiiniumfooliumiga. Pärast 24 tundi pärast UVB-indutseeritud steriilset vigastust allutati kogu UVB-kiirgusega kiiritatud nahapiirkond violetsele valgusele (405 nm), kasutades võimsusel 50 W valgusdioodlampi, millel oli 0,37 numbrilise apertuuriga (NA) kiud (Mightex). 100 mW (säritus 15 min piirkonna kohta). See meetod optimeeriti avaldatud nahaspetsiifilise fotokonversiooni protokolli alusel (80).Neerudja kopsud koguti ja töödeldi voolutsütomeetria analüüsiks 24 tundi pärast PA, nagu ülalpool kirjeldatud. Lähenemisviis ja ajakava on välja toodud joonisel 5A. GFP pluss neutrofiilide protsentneerudvõrreldi sellega, mis leiti hiirtel kolmes kontrolltingimuses: 1) UV-kiirguse ja PA puudumisel, 2) UV-kiirguse puudumisel, kuid PA puudumisel ja 3) UV-kiirguse puudumisel, vaid PA-ga. CXCR4 ekspressioonitasemed ja ICAM1hiCXCR1lo fenotüüp GFP pluss ja GFP− neutrofiilides nahas janeerudhinnati voolutsütomeetria abil, kasutades Biolegendilt ostetud hiirespetsiifilisi fluorestsentsmärgistatud antikehi. Et teha kindlaks, kas GFP pluss neutrofiilidneerudpärines nahast, mitte verest, ühe rühma hiirte nahk puutus kokku UV-valguse ja PA-ga, nagu eespool kirjeldatud (I rühm), samas kui teises rühmas eksponeeriti nahk UV-valgusega, kuid PA viidi läbi külgneval nahapiirkonnal. ei puutu kokku UV-valgusega (II rühm) (skeem SI lisas, joonis S7A).Neerudkoguti ja töödeldi voolutsütomeetria analüüsiks, nagu ülalpool kirjeldatud.

Geeniekspressioon ja proteoomilised analüüsid.Nahk,neerud,ja kopsuproove säilitati RNAlateri lahuses (QIAGEN). RNA ekstraheeriti RNeasy komplektiga QIAGENist ja komplementaarne DNA (cDNA) sünteesiti High Capacity cDNA sünteesikomplekti (Applied Biosystems) abil. Põletikuliste kemokiinide, tsütokiinide ja adhesioonimolekulide transkriptid kvantifitseeriti reaalajas qPCR abil, kasutades SI lisa tabelis S1 loetletud praimereid ja normaliseeriti 18S transkripti tasemete keskmisele. Kasutatud UVB-valguse annus ei mõjutanud 18S ekspressiooni üheski elundis. MRNA sihtmärkide suhteline ekspressioon määrati standardvalemi 2^(-Ct) × koefitsiendi abil. IFN-skoorid saadi 10 tüüpilise interferooniga stimuleeritud geeni (ISG; Mx1, Irf7, Isg15, Isg20, Ifi44, ifit1, ifit3, oasl1, usp18 ja ifi27l2a) ekspressioonist, nagu eelnevalt kirjeldatud (6). Iga ISG suhtelise ekspressiooni keskmine ja SD määratineerudhiirtel, kes ei puutu kokku UV-valgusega (meannoUV ja SDnoUV). Seejärel kasutati neid iga ISG ekspressioonitaseme standardiseerimiseks töödeldud hiirte neerudes (IgG isotüüp pluss UVB või a-GCSF pluss UVB). Seejärel liideti standardiseeritud ekspressioonitasemed iga hiire kohta, et tuletada IFN ekspressiooniskoor; i=iga ISG avaldis; Geeniravi=suhteline geeniekspressiooni tase pärast ravi; ja Gene inoUV=suhteline geeniekspressiooni tase hiirtel, kes ei puutu kokku UVB valgusega. ∑ 10 i=1=Geneitreatment-mean GeneinoUV SD(GeneinoUV ) . Valgu taset plasmas ja nahakoe valguekstraktides mõõdeti määratletud analüütide paneelide LEGENDplex Mouse Inflammation Panel ja Inflammatory Chemokine Panel (Biolegend) abil.

KUI külmunud neerukudede värvumine.Soolalahusega perfuseeritudneerudfikseeriti 4% paraformaldehüüdis 1 tund toatemperatuuril ja pärast sukeldamist 30% sahharoosi külmutati optimaalses lõikekeskkonnas (Sakura Finetek). 5-μm koelõigud rehüdreeriti PBS-is enne IF-värvimist. Kuded permeabiliseeriti 0,1% Triton X-100-ga PBS-is ja seejärel blokeeriti PBS-is, millele lisandus 0,1% Triton X-100/5% BSA-d (veise seerumi albumiin) / 5% küüliku seerumit. . NE ja endoteelirakud tuvastati, värvides vastavalt hiirevastase NE Cy5 (1:100, Bioss) ja hiirevastase PECAM-1/CD31 Al488-ga (1:100, Biolegend) temperatuuril 4 kraadi üleöö. Neutrofiilide olemasolu veresneerudkinnitati värvimisega hiirevastase Ly6G Al647-ga (1:100, Biolegend). Kuded kinnitati ProLong Goldiga koos 4′, 6-diamidino-2-fenüülindooli (DAPI) kinnitusmeediumiga (Invitrogen) ja pildistati Nikon Eclipse 90i fluorestsentsmikroskoobiga (histoloogia ja pildisüdamik, Washingtoni ülikool).

Naha histoloogiline hindamine.Formaliiniga fikseeritud, parafiiniga manustatud nahakoe lõigud (4 kuni 5 μm) värviti Washingtoni Ülikooli histoloogia ja kujutise tuumas hematoksüliini ja eosiiniga enne UV-kiirgust, päeval 1, 2 ja 6 pärast UVB kiiritamist (n {{ 7}} naist). Nahka hinnati pimestatud viisil järgmiste parameetrite järgi: pärisnaha / nahaaluse põletik, epidermise rakusurm, akantoos, hüperkeratoos, serotsellulaarse kooriku moodustumine ja erosioon / haavandid. Neid parameetreid hinnati skaalal 0 kuni 4 sõltuvalt tõsidusest ja ulatusest, välja arvatud erosioon/haavand, mis hinnati kas esinevaks (1) või puudumiseks (0). Tüüpilised pildid tehti NIS-Elements BR 3.{14}}bitiga ja plaaditi Adobe Photoshopiga koos valgustuse reguleerimisega kogu pildile. Esitatud on originaalsuurendus.

Uriini mõõtmised.Uriini valgu taset hinnati Bradfordi valguanalüüsiga (Thermo Fisher Scientific). Uriiniproove testiti 1:40 lahjenduses PBS-is ja valgu kontsentratsioon uriinis määrati teadaolevate BSA kontsentratsioonide seerialahjenduste põhjal. Uriini albumiini/kreatiniini suhet hinnati Albuwelli albumiini testi ja Creatinine Companion Kit (Exocell) abil vastavalt tootja juhistele.

Inimese proovide kogumine ja voolutsütomeetria analüüs.Selle uuringu kiitis heaks Washingtoni ülikooli institutsioonide ülevaatenõukogu (STUDY00001145). Tervetelt vabatahtlikelt ja SLE-ga patsientidelt pärast teadlikku nõusolekut koguti täisveri hepariniseeritud katsutitesse. Neutrofiilid (PMN-id) ja PBMC-d eraldati Ficoll-Paque katkendliku gradiendi eraldamisega (GE Healthcare). PMN-id puhastati erütrotsüütide pelletist 5-protsendilise dekstraani settimisega. Pärast erütrotsüütide lüüsimist värviti rakud fluorestsentsmärgistatud antikehadega, mis osteti ettevõttest Biolegend, ning CXCR4 ekspressiooni ja ICAM1hiCXCR1lo rakkude protsenti hinnati PMN-ides (CD66b pluss) ja LDG-des (CD15 pluss, CD14lo ja CD10 pluss PBMC-des (19)). FMO-l põhinev LDG-de ja ICAM1hiCXCR1lo värvimise väravastrateegia on näidatud SI lisas, joonisel S11. Proove töödeldi CytoFLEX voolutsütomeetriga (Beckman Coulter) ja andmeid analüüsiti FlowJo tarkvara versiooniga 10 (Tree Star).

Statistilised analüüsid.Andmeid analüüsiti GraphPad Prism 7 tarkvaraga (GraphPad Software Inc.) ja esitati kui keskmine ± SEM. Statistiline erinevus kahe andmerühma vahel määrati kiiritamata kontrollide suhtes (D-1), kasutades Studenti testi. Kolme rühma vahelise statistilise olulisuse määramiseks kasutati ühesuunalist ANOVA-d mitme võrdlusega ja Tukey post hoc.