Tegevuse juhitud fenoolsete kompositsioonide eraldamine Anneslea Fragransi seinast. Ja nende tsütoprotektiivne toime vesinikperoksiidi poolt põhjustatud oksüdatiivse stressi vastu HepG2 rakkudes, 2. osa

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

2.7. Inhibeeriv toime intratsellulaarsele ROS-i tekkele

Oksüdatiivne stress on teatud tüüpi tasakaalustamatus oksüdatsiooni ja antioksüdatsiooni vahel kehas [28]. ROS-i liigne kogunemine võib põhjustada oksüdatiivset stressi, mis võib kahjustada rakke ja kudesid, nagu lipiidid, membraanid ja DNA [29]. Antioksüdandid, sealhulgas polüfenoolid ja flavonoidid, võivad aidata kehal neid ROS-i põhjustatud kahjustusi vähendada. Üldiselt kasutatakse H, O laialdaselt rakusisese ROS-i häiritud tootmise esilekutsumiseks ja rakkude antioksüdantse kaitse kahjustamiseks [30]. Meie praeguses uuringus valiti H2O2, et kutsuda esile intratsellulaarse ROS-i ebanormaalne akumulatsioon ja kahjustada rakkude antioksüdantset kaitset. Inhibeeriva toime hindamiseks intratsellulaarsele ROS-i tekkele H, O2--indutseeritud HepG2 rakkudes testiti rakusisese ROS-i taset voolutsütomeetria abil. Lühidalt, HepG2 rakke kultiveeriti 6-süvendiga plaadil (1 × 10 kraadi rakke süvendi kohta). Pärast 24-tunnist 50 ug/ml erinevate ekstraktide või 8 ug/ml Vc (positiivne rühm) inkubeerimist indutseeriti kõiki rühmi, välja arvatud kontrollrühm, 6 tundi H202-ga. Testiti iga ühendi rakusisest ROS-i taset (joonis 3). ROS-i tekkesuhe suurenes oluliselt 215,64 ± 9,80 protsendini H2O-s – ravitud rühm võrreldes kontrollrühmaga (100 protsenti). Võrreldes H, O-ga töödeldud rühmaga pärssisid ühendid 2, 5 ja 6 märkimisväärselt intratsellulaarset ROS-i tootmist (p<0.05), and="" their="" inhibitory="" effect="" was="" equal="" to="" the="" vc="" group="" (figure="" 3).="" many="" phenolics="" have="" been="" proven="" to="" have="" a="" protective="" effect="" against="" intracellular="" ros="" by="" h2o2="" induction[31].="" additionally,="" compound="" 6="" displayed="" the="" strongest="" suppressive="" effect="" on="" intracellular="" ros="" production,="" which="" suggests="" that="" flavonoid="" compounds="" play="" a="" crucial="" role="" in="" inhibiting="" intracellular="" ros="">

2.8. Tsütoprotektiivne toime H2O2-indutseeritud rakuapoptoosi vastu

Apoptoos on rakkude bioloogiline põhinähtus, mis mängib olulist rolli rakkude proliferatsiooni, kasvu ja mutatsiooni regulatsioonimehhanismis ning sisekeskkonna stabiilsuses. Apoptoos, mis erineb nekroosist, on rakusurma eritüüp. Apoptootilise protsessi häire avaldab kehale halba mõju ja põhjustab paljusid haigusi [32]. H2O2 kui oluline signaalmolekul reguleerib rakkude proliferatsiooni, kasvu ja apoptoosi protsessi [5]. Käesolevas uuringus mõõdeti H, O-indutseeritud HepG2 rakkude apoptoosi ja hinnati ühendite 2, 5 ja 6 tsütoprotektiivset toimet. Pärast HepG2 rakkude töötlemist 10 mM H2O2-ga suurenes apoptoosi suhe märkimisväärselt ( 57,20±1,97 protsenti ), võrreldes kontrollrühma omaga (9,10±0,62 protsenti ,p<0.05)(figure 4).="" the="" ratios="" of="" apoptotic="" cells="" in="" the="" treated="" groups="" of="" compounds="" 2,="" 5,="" and="" 6="" significantly="" decreased="" compared="" with="" the="" h2o2-treated="" group="" (model="" group,=""><0.05)(figure 4).="" moreover,="" compound="" 6="" had="" significant="" efficiency="" in="" protecting="" hepa-2="" cells="" from="" h2o2="" toxicity,="" and="" the="" cell="" apoptosis="" ratio="" of="" 6(10.56±1.15%)was="" lower="" than="" that="" of="" the="" vc="" group="" (positive="" control),="" which="" was="" equal="" to="" that="" of="" the="" control="" group(figure="" 4).="" meanwhile,="" compounds="" 2="" and="" 5="" showed="" a="" moderate="" cytoprotective="" effect="" with="" cell="" apoptosis="" ratios="" of="" 2(26.76±2.60%)="" and="" 5(27.64±0.83%).="" the="" differences="" in="" antioxidant="" capacity="" may="" be="" attributed="" to="" the="" number="" of="" phenolic="" hydroxyl="" moieties="" and="" the="" link="">

3. Materjalid ja meetodid

3.1. Kemikaalid ja reaktiivid

Kõrgfektiivne vedelikkromatograafia (HPLC) metanool, atsetonitriil ja sipelghape olid HPLC puhtusega ja ostetud ettevõttest Merck (Darmstadt, Saksamaa). Proovide ekstraheerimiseks kasutatavad lahustid, sealhulgas etanool, diklorometaan ja n-butanool, olid analüütilise puhtusega. Deioniseeritud vesi puhastati Milli-Q ülipuhta veesüsteemiga (Millipore, Bedford, Massachusetts, MA, USA) ja seda kasutati kõigis katsetes. Gallushappe, rutiini, Troloxi ja C-vitamiini fenoolsed standardühendid osteti ettevõttelt Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Hiina). Metüültiasool-2-üül-25-difenüültetrasooliumbromiid (MTT), Folin-Ciocalteu reaktiiv, 2,2'-ja bis(3-etüülbenseentiasoliin-6-sulfoonhape)( ABTS),2,2-difenüül-1-pikrüülhüdrasüülradikaal (DPPH), 1,3,5-tri(2-püridüül)-2,4,{{23 }}triasiin (TPTZ), 2',7'-diklorofluorestseiindiatsetaat (DCFH-DA) ja FeSO{28}}osteti ettevõttelt Sigma-Aldrich (Shanghai, Hiina). NMR-spektrid saadi Bruker AV-400 ja/või DRX-500 spektromeetritega. ESIMS spektrid registreeriti An Agilent 1290 UPLC/6540 Q-TOF spektromeetriga.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

3.2. Proovi ettevalmistamine

Anneslea lõhnav sein. lehed koguti Hiinast Lincangi linnast 2. juulil020. Lehed kuivatati varjulises ruumis konstantse kaaluni ja seejärel pulbristati elektrilise veskiga. Ekstraheerimine ja fraktsioneerimine viidi läbi meie varem teatatud meetodina, vähese modifikatsiooniga [33]. Pulbristatud proovi (100 g) segati 1000 ml 80% etanooli vesilahusega ja ultraheliga puhastati ultrahelipuhastusvannis 200 W juures kolm korda (0,5 h korraga). Seejärel koguti ultraheliga töödeldud suspensioon ja tsentrifuugiti 1500 × g juures 10 minutit Eppendorfi tsentrifuugis (TGL-20B, Shanghai Anting Scientific Instrument Factory, Shanghai, Hiina). Kombineeritud supernatant kontsentreeriti 50 kraadi juures rotaatoraurustis (Hei-VAP, Heidolph, Saksamaa) ja kuivatati täiendavalt vaakumkuivatuslüofilisaatoris (Alpha 1-2 LD plus, Christ, Saksamaa). Tooretanooliekstrakt (CE, 30 g) suspendeeriti uuesti vees ja jaotati kolm korda järjestikku diklorometaani, etüülatsetaadi ja n-butanooli lahustitega. Pärast kontsentreerimist ja lüofiliseerimist saadi diklorometaani fraktsioon (DF), etüülatsetaadi fraktsioon (EAF), n-butanooli fraktsioon (BF) ja jääkveefraktsioon (RWF), mis kaalusid 3,2 g, 6,3 g, 7,2 g ja 8,2 g. , vastavalt. Vastavalt erinevate fraktsioonide antioksüdantsele toimele kromatografeeriti BF klaaskolonnidel (30 mm × 400 mm), mis olid märgpakitud 20 g (kuiv vaik) valitud hüdraatvaiguga D101. Vaigu kihi maht (BV) oli umbes 40 ml. Pärast adsorptsiooni küllastumise saavutamist pesti kolonni esmalt destilleeritud veega 4 × BV ja seejärel elueeriti etanooli ja vee seguga (0:100, 20:80, 50:50, 80:20, 100:0, v/a, igaüks 4 × BV), et saada viis alamfraktsiooni (BF-A kuni E). Kõik desorptsioonilahuste osad kontsentreeriti vaakumis kuivaks. CE-d, nelja fraktsiooni (DF, EAF, BF ja RWF) ja viit alamfraktsiooni (BF-A kuni E) säilitati edasiseks katsetamiseks külmkapis (-20 kraadi).

3.3. Aktiivsete koostisosade bioloogiliselt juhitud eraldamine

Antioksüdantanalüüside ja HPLC analüüsi juhtimisel kromatografeeriti antioksüdatiivne fraktsioon puhaste ühendite eraldamiseks. Lühidalt, BF allutati hüdraaditud vaigu D101 kolonnile, et saada viis alamfraktsiooni (BF-A kuni E). BF-C (1,5 g) allutati silikageelikolonnile, elueerides DCM/MeOH-ga (15:1), ja seejärel eraldati preparatiivse TLC-ga (DCM/MeOH, 10:1), et saada ühendid 6 (118 mg). ) ja 7 (10 mg). BF-D (1,1 g) töödeldi silikageelikolonnis (CHCl3/MeOH 10:1, 5:1), saades ühendid 1 (129 mg) ja 4 (15 mg). BF-E (1,2 g) töödeldi silikageelikolonnis (CHCl3/MeOH, 30:1, 10:1, 5:1), et saada ühendid 1 (216 mg), 2 (135 mg) ja segu. Viimane puhastati silikageelikolonniga (CHCl3/MeOH). 12:1), et saada ühendid 3 (19 mg) ja 5 (15 mg) (joonis 5).

3.4. Ühendite struktuuri selgitamine 1-7

Vastavalt erinevate fraktsioonide antioksüdantsele toimele viidi kolonnkromatograafiasse kolm alafraktsiooni BF-C kuni E. Sel viisil viis BF-C bioaktiivsusest juhitud fraktsioneerimine E-ks seitsme individuaalse fenoolühendi eraldamiseni. Nende struktuurid tuvastati kui konfusosiid(1)[34], vaktsiinifoliin (2)[34], 1-[4-( -D-glükopüranosüüloksü)-2-hüdroksüfenüül]-3- (4-hüdroksü-3-metoksüfenüül)-1-propanoon (3) [35], (S)-naringeniin-7-O- -D-glükopüranosiid (4)[ 22],2',3,4,4'-tetrahüdroksüdihüdrokalkoon(5)[26], (epi)katehhiin (6)[26] ja kornosiid (7)[36] (joonis 1B) 1D analüüsi põhjal -NMR ja ESI-MS andmed ning võrdlus kirjanduses varem avaldatud ühenditega. Nende hulgas eraldati sellest taimest esimest korda ühendid 3, 4 ja 7.

Cistanche võib parandada immuunsust

Segadus (1). Molekulaarvalemiks määrati C21H24O ja eraldamine andis 129 mg kahvatukollaseid nõelu. 'IH NMR (500 MHz, DMSO-d6) ja ESI-MS (m/z 421 [M pluss H]) andmed olid identsed kirjanduses varem avaldatud ühendiga [34]. Identifitseerimist toetas veel 13C NMR (125 MHz, DMSO-dg) ∶δ204,4 s, C=O), 163,5 (s, C-2'), 163,3 (s, C). -4'), 155,5 (s, C-4), 132,6 (d, C-6'), 130,9 (s, C-1), 129,2 (d, C) -2, 6), 115,0 (d, C-3/C-5), 114,4 (s, C-1'), 108,3 (d, C{{45} }'), 103,4 (d, C-1"), 99,6 (d, C-3'), 77,1 (d, C-5"), 76,4 (d, C{{ 57}}"), 73,1 (d, C-2"), 69,5 (d, C4'), 60,5 (t, C-6'), 39,8 (t, C-), 28,9( t, C-6).

Vaktsiiniifoliin (2) saadi kollase amorfse pulbrina (153 mg) ja selle molekulvalemiks määrati C2H24O1o.'H NMR (500 MHz, DMSO-dg) ja ESI-MS (m/z 437 [M) pluss H]) andmed olid samad, mis eelmistes esitatud andmetes [34]. Tuvastamist toetas veel 13CNMR (125 MHz, DMSO-de）∶δ204,4（s, C=O）, 163,5（s, C-2'）, 163,3 (s, C{) {21}}), 145,0(s, C-3), 143,3(s, C-4), 132,6(d, C-6), 131,7(s, C{{33) }}), 118,9(d, C-6), 115,8(d, C-2), 115,4(d, C-5), 114,4(s, C-1 '), 108,3 (d, C-5'), 103,4 (d, C-1'), 99,6 (d, C-3'), 77,1 (d, C{{57) }}"), 76,4 (d, C-3'), 73,1 (d, C-2"), 69,5 (d, C-4'), 60,5 (t, C{ {69}}'), 39,4 (t, Ca), 29,1 (t, C-6).

{{0}}[4-( -D-glükopüranosüüloksü)-2-hüdroksüfenüül]-3-(4-hüdroksü-3-metoksüfenüül){{8 }}propanoon (3). Ühend saadi värvitute nõeltena (19 mg) ja molekulivalemiks määrati C22H2O10.'H NMR (400 MHz, DMSO-d6) ja ESI-MS (m/z451 [M pluss H]* ) kirjandusega kooskõlas olevad andmed [35]. Tuvastamist toetas veel 13CNMR (100 MHz, DMSO-d）∶δ204,5（s, C=O）, 163,5（s, C-2'）, 163,3（s, C{ {31}}'）, 147,4（s, C-3), 144,6(s, C-4), 132,6(d, C-6), 131,6(s, C{{ 43}}), 120,4 (d, C-6), 115,2 (d, C-5), 114,5 (s, C-1'), 112,6 (d, C{{55) }}), 108,3 (d, C-5'), 103,3 (d, C-1"), 99,5 (d, C-3'), 77,0 (d, C{{ 67}}'), 76,3 (d, C-3"), 73,0 (d, C-2"), 69,5 (d, C-4'), 60,5 (t, C -6'), 55,5 (q, C-OCH3), 39,5 (t, C-), 29,4 (t, C{89}}).

(S)-naringeniini-7-O- -D-glükopüranosiidi (4) molekulvalem oli C21H2.O10, mis saadi 15 mg valge pulbrina. IH NMR (500 MHz, DMSO-dg) ja ESI-MS (m/z 435 [M pluss H] pluss) andmed olid kooskõlas eelmise tööga[22]. Tuvastamist toetas veel13C NMR (125 MHz, DMSO-d）∶δ197,2（s, C-4）, 165,3（s, C-7）, 165,2 (s, C{{25) }}), 162,9(s, C-9), 157,9(s, C-4'), 128,6(s, C-1'), 128,4(d, C{{37) }}',6'), 115,2 (d, C-3'/C-5'), 1{{110}}3,2 (s, C-10 ), 99,6 (d, C-1'), 96,5 (d, C-6), 95,4 (d, C-8), 78,7 (d, C-2) ,77.{182}}(d, C{{6{{240}}}"), 76,3 (d, C-3'), 73,0(d, C{{ 66}}"), 69,5 (d, C-4'), 60,5 (t, C-6'), 42,0 (t, C-3). 2'3,4,A'-tetrahüdroksüdihüdrokalkoon (5) oli molekulvalemiga C15H4O5 ja eraldus (15 mg) valge pulbrina.'H NMR (400 MHz, DMSO-dg) ja ESI-MS (m/z 275 [ M pluss H] plus ) andmed olid kooskõlas kirjanduses avaldatutega [26]. Tuvastamist toetas veel 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6）∶δ203,9 s, C=O）, 164,7(s, C{99}}'), 164,2(s, C). -4'), 144,9(s, C-3), 143,3(s, C-4), 133,0(d, C-6), 131,8(s, C{ {114}}), 118,9 (d, C-6), 115,7 (d, C-2), 115,4 (d, C-5), 112,5 (s, C{{126) }}), 108,2 (d, C-5'), 102,4 (d, C-3'), 39,5 (t, C-a2), 29,2 (t, CB). (Epi)-katehhiin(6) eraldati valge pulbrina (118 mg) ja molekulaarvalemiks määrati CHO4.1H NMR (400 MHz, DMSO-dg) ja ESI-MS (m/z 291 [M pluss H] pluss )andmed ühtisid hästi kirjanduses avaldatutega [26]. Tuvastamist toetas veel13C NMR (125 MHz, DMSO-d6）∶δ156,4（s, C{156}}）, 156,1（s, C-5）, 155,3（s, C{162). }}）, 144,8 (s, C-3'), 144,8 (s, C-4'), 130,5 (s, C-1'), 118,4 (d, C{{ 174}}'), 115,0 (d, C-5'), 114,4 (d, C-2'), 99,0 (s, C-10), 95,1 (d, C{ {186}}), 93,8 (d, C-8), 80,9(d, C-2), 66,2 (d, C-3), 27,8 (t, C{{198) }}). Kornosiid (7) saadi amorfse tahkisena (10 mg) ja molekulaarvalemiks määrati C1H20O8.'H NMR (500 MHz, DMSO-dg) ja ESI-MS (m/z317 [M pluss H] pluss) andmed vastasid avaldatud andmed [36]. Tuvastamist toetas veel 13CNMR (100 MHz, DMSO-dg）∶δ185,3（s, C-4）, 153,3（d, C-2）, 153,2 d, C{{220). }}）, 126,4 (d, C-3), 126,4 (d, C-5), 102,8 (d, C-1'), 76,8 (d, C{{232} }'), 76,6 (d, C-3'), 73,3 (d, C-2'), 70,0 (d, C-4), 67,3 (s, C{244) }}), 63,8 (t, C-8), 61,0 (t, C-6'), 39,7 (t, C-7).

3.5. Üldfenoolisisalduse (TPC) ja flavonoidide üldsisalduse (TFC) määramine

Nelja fraktsiooni (DF, EAE, BF ja RWF) ja viie alamfraktsiooni (BF-A kuni E) TPC ja TFC mõõdeti vastavalt meie varem teatatud meetodile [37]. TFC jaoks segati 1.0 ml iga metanoolis lahustatud proovi (kontsentratsiooniga 1.0 mg/mL) 0,5 ml Folin-Ciocalteu reagendiga lahuses. tsentrifuugiklaasi ja inkubeeriti 1 min. Seejärel lisati tuubi 20 protsenti Na2CO3 lahust (m/o) (1,5 ml) ja deioniseeritud vett (7,0 ml) ning hoiti 10 minutit 70 kraadi juures veevannis. Pärast toatemperatuurini jahutamist kanti 200 uL lahust 96-süvendiga mikroplaadile ja neelduvus määrati 765 nm juures mikroplaadilugejaga SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

TFC jaoks segati 1,2 ml proovilahuseid (kontsentratsiooniga 10 mg/ml) 0,3 ml NaNO-ga (5% m/o) ja 3,8 ml 7-ga. 0% etanooli vesilahust ja inkubeeriti 8 minutit. Seejärel lisati segule 0,3 ml 10% Al(NO3), 4 ml4% NaOH vesilahust ja 0,4 ml 70% etanooli vesilahust. ja lasti toatemperatuuril 30 minutit reageerida. Seejärel kanti 200 μL lahust 96-süvendiga mikroplaadile, mille neeldumist mõõdeti mikroplaadilugeja abil lainepikkusel 510 nm. TFC ja TPC väljendati gallushappe ekvivalentidena (mg GAE/gekstrakt) ja rutiini ekvivalentidena ühe grammi ekstrakti kohta (mg RE/g ekstrakti kohta).

3.6.Antioksüdantse aktiivsuse määramine

Nelja fraktsiooni (DF, EAF, BF ja RWF) ja viie alamfraktsiooni (BF-A kuni E) antioksüdantset aktiivsust hinnati DPPH ja ABTS radikaali püüdmise testide ja FRAP testi kombinatsioonis meie eelmises uuringus kirjeldatud meetodil. [33]. DPPH testi jaoks segati 50μL proovilahust (50,100,200 ug/mL) 0,2 ml DPPH lahusega (0,1 mmol/). L) 96-süvendiga plaadile ja lasti 30 minutit inkubeerida. Neeldumist mõõdeti lainepikkusel 517 nm mikroplaadilugejaga SpectraMax M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). ABTS-i jaoks lisati 25 µl proovilahust (50, 100, 200 ug/mL) 0,2 mLABTS-i lahusele (7 mmol). /L).Segu hoiti 6 minutit pimedas ja seejärel registreeriti neeldumine lainepikkusel 734 nm. FRAP jaoks segati 20 μL proovilahust (50 100 200 ug/mL) 0,18 ml FRAP reagendiga (7 mmol/ L). Pärast 10-minutilist inkubeerimist pimedas 37 kraadi juures määrati neeldumine lainepikkusel 593 nm. Kõik testid viidi läbi kolmes korduses. DPPH, ABTS ja FRAP väärtuste tulemused väljendati umol Troloxi ekvivalentidena grammi kohta. ekstrakt (μmol TE/g ekstrakti).

3.7.HPLC analüüs

BF-i ja ühendeid {{0}} analüüsiti Agilent 1260 HPLC-süsteemis, mis oli ühendatud dioodirea detektoriga. Enne analüüsimist filtriti värskelt valmistatud proovilahus läbi 0,45 um nailonmembraani. Eraldamiseks kasutati kolonni Reprosil-Pur Basic C18 (5 μm, 4,6 × 25{16}} mm, Saksamaa), mida hoiti 35 kraadi juures. Süstimismaht oli 5, 0 μL, voolukiirus oli 1, 0 ml / min ja tuvastamise lainepikkuseks määrati 280 nm. Liikuvad faasid olid hapestatud vesi 0,1% sipelghappega (faas A) ja atsetonitriil (faas B), lineaarne gradientelueerimine viidi läbi järgmiselt: 0-3 min, 20% B; 3-10 min, 40 protsenti B; 10-15 min, 60 protsenti B; 15-20 min, 100 protsenti B.

3.8. Rakukultuur ja rakkude elujõulisus

Inimese maksavähi HepG2 rakud osteti Kunmingi rakupangast (Kunming, Hiina). HepG2 rakke kasvatati DME-s, millele oli lisatud 1% penitsilliini-streptomütsiini ja 10% veise loote seerumit, atmosfääris, mis sisaldas 5% CO ja 95% õhku 37 kraadi juures. Kui rakke inkubeeriti sobiva tihedusega (ligikaudu 80%), neid töödeldi edasisteks katseteks positiivse kontrolli (Vc) ja eraldatud ühenditega.

Rakkude elujõulisus määrati MTT testiga, et hinnata iga proovi tsütotoksilisust [29]. Rakud tihedusega 1 × 104 rakku süvendi kohta külvati 96-süvendiga plaadile ja neil lasti inkubeerida 24 tundi. Iga ühend (valmistatud nelja annusena vahemikus 50 kuni 200 ug/mL) lisati igasse süvendisse 20 tunniks. Seejärel töödeldi rakke MTT lahusega lõppkontsentratsiooniga 4 tundi. MTT-ga sööde eemaldati ja 200 Formasaani lahustamiseks lisati μL DMSO-d. Neelduvus registreeriti mikroplaadilugejaga lainepikkusel 570 nm. Tulemused näitasid, et iga ühend ei olnud testitud kontsentratsioonidel HepG2 rakkudele toksiline.

3.9. ROS-i tekke pärssimine H2O2-indutseeritud HepG2 rakkudes

ROS-i tootmist inhibeeriva toime määramiseks kasutati H, O-indutseeritud HepG2 rakke [3]. HepG2 rakud (1.0×10 kraadi rakku süvendi kohta) külvati 6-süvendiga plaadile ja kultiveeriti koos isoleeritud ühenditega kontsentratsiooniga 50 ug/ml ja Vc（8 ug/ ml) Pärast 20-tunnist inkubeerimist sööde eemaldati ja igasse süvendisse lisati veel 6 tunniks 2 µl H, O (0,5 mM). Katse lõpus märgistati rakud 2 μL DCFH-DA (10 mM) pimedas temperatuuril 37 kraadi 20 minutit. Neelduvus registreeriti voolutsütomeetria abil (Guajaa lihtne, kuid 6-2L, Millipore, Billerica, Massachusetts, MA, USA).

3.10.Raku apoptoosi määramine

Iga ühendi kaitsev toime H2O2-indutseeritud HepG2 rakkude apoptoosile määrati, kasutades inimese anneksiin VFITC/PI apoptoosikomplekti [38]. HepG2 rakke töödeldi eelnevalt isoleeritud ühenditega või ilma nendeta 48 tundi. Pärast inkubeerimist lisati rakkudele 100 μL sidumispuhvrit ja rakud reageerisid pimedas 10 μL anneksiin V-FITC-ga 5 minutit toatemperatuuril ja 10 μL propiidiumjodiidiga (PI) jäävannis 5 minutit. min järjestikku. Rakkude apoptoosi analüüsiti koheselt voolutsütomeetria abil.

3.11.Statistiline analüüs

Kõik katsed viidi läbi kolmes eksemplaris. Kõik väärtused on väljendatud keskmisena ± standardhälbe (SD). Rühmasiseseid ja rühmadevahelisi erinevusi analüüsiti ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, millele järgnes Tukey test. Erinevust peeti statistiliselt oluliseks p<0.05. all="" analyses="" were="" performed="" using="" origin="" 2019b="" software="" (originlab,="" northampton,="" ma,="">

4. Järeldused

Selles uuringus fraktsioneeriti A.fragransi lehtede erinevad fraktsioonid ning analüüsiti nende TPC-d ja TFC-d. Antioksüdantse toimega juhitud isoleerimisel eraldati ja identifitseeriti A. fragransi lehtedest ühendid 1-7, sealhulgas neli flavonoidglükosiidi (1-4) ja kaks flavonoidi (5 ja 6), mis viitab sellele, et see liik on rikas. flavonoidühendites. Ühendid 2, 5 ja 6 näitasid olulist antioksüdantset aktiivsust DPPH, ABTS radikaali püüdmise ja FRAP testides. Lisaks hoidsid nad nähtavalt ära oksüdatiivse stressi kahjustuse, vähendades ROS-i sisaldust ja raku apoptoosi H2O2-indutseeritud HepG2 rakkudes. Nende tulemuste kohaselt on polüfenoolühenditel, eriti flavonoididel, nende fenoolsete hüdroksüülrühmade tõttu märkimisväärne antioksüdantne võime. Lisaks oli ühend 2, millel on glükosiidosa ja kolm fenoolset hüdroksüülrühma, peamine antioksüdantne komponent, mille sisaldus A. fragrans'i lehtedes oli kõrgeim. Ühendil 6 oli parim antioksüdantne aktiivsus, mis võib olla A. fragransi aktiivsuse suur panus. Lisaks võiks A. fragransi ekstrakte serveerida lootustandvate tervisejookide loodusliku antioksüdantide allikana. Uuring A. fragransi lehtedest pärinevate ühendite kohta viitab sellele, et neid võiks serveerida antioksüdantse tervisliku teena oksüdatiivsest stressist põhjustatud rakukahjustuste raviks ning toidu- ja tervishoiutööstuses kasutatavate toidulisanditena.

See artikkel on välja võetud ajakirjast Molecules 2021, 26, 3690. https://doi.org/10.3390/molecules26123690 https://www.mdpi.com/journal/molecules