Hirmu mälufaasi aktiivne üleminek taasühinemisest väljasuremisele ERK-vahendatud taaskonsolideerimise ennetamise kaudu

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Thehirmumälu taastaminekutsub esile kaks vastandlikku mäluprotsessi, st taaskonsolideerumist ja väljasuremist. Lühiajaline otsimine kutsub esile uuesti konsolideerimise, et säilitada võitugevdada hirmu mälu,samas kui pikaajaline otsimine kustutab selle mälu. Kuigi taaskonsolideerimise ja väljasuremise mehhanisme on uuritud, jääb teadmata, kuidas mälu otsimise ajal lülituvad hirmumälu faasid taaskonsolideerimiselt väljasuremisele. Siin näitame, et ekstratsellulaarsest signaalist reguleeritud kinaasist (ERK) sõltuv mälu üleminekuprotsess pärast otsimist reguleerib mälufaaside ümberlülitumist taaskonsolideerimisest väljasuremiseni, vältides isastel hiirtel taaskonsolidatsiooni esilekutsumist inhibeeriva vältimise (IA) ülesandes. Esiteks tuvastati pärast taaskonsolideerimist, kuid enne väljasuremisfaase üleminekumälu faas, mis tühistab taaskonsolidatsiooni esilekutsumise, kuid on ebapiisav ekstinktsiooni omandamiseks. Teiseks näitasid taaskonsolideerimis-, ülemineku- ja väljasuremisfaasid pärast mälu otsimist selgeid molekulaarseid ja rakulisi allkirju cAMP-le reageeriva elementi siduva valgu (CREB) ja ERK fosforüülimise kaudu mandelkehas, hipokampuses ja mediaalses prefrontaalses ajukoores (mPFC). Taaskonsolideerimisfaas näitas nendes ajupiirkondades suurenenud CREB fosforüülimist, samas kui väljasuremise faas näitas mitut närvipopulatsiooni koos CREB ja/või ERK fosforüülimise erinevate kombinatsioonidega. Huvitav on see, et kolm mälufaasi, sealhulgas üleminekufaas, näitasid mööduvat ERK aktiveerimist kohe pärast otsimist. Kõige tähtsam on see, et ERK blokaad amügdalas, hipokampuses või mPFC-s üleminekumälu faasis takistas IA-mälu taastamisest põhjustatud paranemist. Need tähelepanekud viitavad sellele, et ERK signaalirada reguleerib aktiivselt mälufaasi üleminekut taaskonsolideerimisest väljasuremiseni ja see protsess toimib lülitina, mis tühistab hirmu taaskonsolideerimise.mälu.

Märksõnad: ERK; väljasuremine;hirmu mälu; taaskonsolideerimine; üleminek

1 Bioteaduste osakond, Tokyo Põllumajandusülikooli bioteaduste teaduskond, Tokyo 156-8502, Jaapan ja

2 Graduate School of Agriculture and Life Sciences, Tokyo Ülikool, Tokyo 113-8657, Jaapan

Olulisuse avaldus

Hirmumälu taastaminekutsub esile kaks vastandlikku mäluprotsessi; taasühendamine ja väljasuremine. Ümberkonsolideerimine säilitab/suurendab hirmude mälu, samas kui väljasuremine nõrgestab hirmumälu. Jääb teadmata, kuidas mälufaasid taaskonsolideerimisest väljasuremise ajal lülituvad välja. Siin tuvastasime aktiivse mälu üleminekuprotsessi, mis toimib lülitina, mis pärsib taaskonsolideerimist. See mälu üleminekufaas näitas ekstratsellulaarse signaaliga reguleeritud kinaasi (ERK) fosforüülimise mööduvat suurenemist amügdalas, hipokampuses ja mediaalses prefrontaalses ajukoores (mPFC). Huvitav on see, et ERK inhibeerimine nendes piirkondades üleminekufaasis pärssis inhibeeriva vältimise (IA) mälu taaskonsolideerimise poolt vahendatud paranemist. Need leiud viitavad sellele, et üleminekumälu protsess reguleerib aktiivselt hirmumälu hirmumälu faaside lülitumist, takistades ERK-signaaliraja aktiveerimise kaudu konsolideerumise esilekutsumist.

Sissejuhatus

Mälu taastamineei ole passiivne protsess, vaid pigem dünaamiline protsess, mis võimaldab säilitada, tugevdada, nõrgendada või muuta/uuendada algset mälu (Misanin et al., 1968; Schneider ja Sherman, 1968; Lewis, 1979; Mactutus et al. , 1979; Gordon, 1981; Nader et al., 2000; Nader ja Hardt, 2009; Dudai, 2012; Fukushima jt, 2014). Oluline on see, et konditsioneeritud hirmumälu, mis on saadud konditsioneeritud stiimuliga (CS) lühidal uuesti kokku puutudes, muutub labiilseks ja nõuab selle säilitamiseks või tugevdamiseks geeniekspressioonist sõltuvat taastamist (Nader et al., 2000; Dudai, 2002; Kida et al., 2002; Suzuki et al., 2004; Tronel jt, 2005; Fukushima jt, 2014). Vastupidi, pidev või korduv korduv kokkupuude CS-ga kutsub esile mälu väljasuremise, mis nõrgendab hirmumälu (Pavlov, 1927; Rescorla, 2001; Myers ja Davis, 2002). Seega,hirmumälu taastamineindutseerib kaks vastandlikku mäluprotsessi, st taaskonsolideerumist ja väljasuremist, kuigi mõlemad protsessid indutseeritakse identse CS-ga uuesti kokkupuutumisel, kuid need erinevad vastavalt CS-ga uuesti kokkupuute kestusele.

Taaskonsolideerimise ja väljasuremise ühine ja kriitiline biokeemiline tunnus on nõue cAMP-responsive element-binding protein (CREB)-vahendatud geeniekspressiooni järele (Mamiya et al., 2009). Huvitaval kombel oleme näidanud kontrastseid molekulaarseid, anatoomilisi ja käitumuslikke allkirju kontekstuaalse hirmumälu taastamise ja väljasuremise faaside vahel (Suzuki et al., 2004; Mamiya et al., 2009). Valgusünteesi blokeerimine taaskonsolideerimisfaasis häirib algset hirmumälu, samas kui valgusünteesi blokeerimine väljasuremisfaasis ei suuda seda teha, kuigi kontekstuaalne hirmumälu aktiveerus uuesti. CREB-vahendatud geeniekspressiooni aktiveerimist näitavate ajupiirkondade nõue erineb taaskonsolideerimise ja väljasuremise vahel; taaskonsolideerimine sõltub amügdalast ja hipokampusest, samas kui väljasuremine sõltub amygdalast ja mediaalsest prefrontaalsest ajukoorest (mPFC). Amygdaloid CREB aktiveerimise ajaline kulg erineb aga taaskonsolideerimise ja väljasuremise mälufaaside vahel. Need tähelepanekud näitasid, et taaskonsolideerimise ja väljasuremise faasid ei ole sõltumatud, vaid pigem suhtlevad üksteisega. Huvitaval kombel on hiljutised uuringud tuvastanud ajaakna (üleminekufaas), mis ei näita rakuvälise signaaliga reguleeritud kinaasi (ERK) aktiveerimist mandelkehas pärast taaskonsolideerimist, vaid enne kuulmishirmu mälu taastamist järgnenud väljasuremisfaase (Merlo et al., 2018). ). Kokkuvõttes viitavad need leiud võimalikele mehhanismidele, mille abil lülituvad mälufaasid taaskonsolideerimiselt väljasuremisele.hirmumälu taastamine. Teisisõnu, on võimalik, et mälu ülemineku protsess reguleerib seda lülitit aktiivselt.

Inhibeeriva vältimise (IA) ülesande puhul saavad hiired elektrilise jalalöögi pärast seda, kui nad sisenevad heledast kambrist pimedasse kambrisse ja moodustuvadmäluet vältida pimedat sektsiooni. Varem näitasime seda ülesannet kasutades, et taasühendamise ja väljasuremise faase saab eristada ajahetkel, mil hiir siseneb kordussärituse seansi ajal heledast kambrist pimedasse kambrisse (Fukushima et al., 2014). Seetõttu võimaldab see ülesanne iseloomustada taaskonsolideerimise ja väljasuremise faasi perspektiivseid molekulaarseid signatuure, erinevalt klassikalisest kontekstuaalsest hirmu tingimise paradigmast, mille puhul konditsioneeritud hirmumälu taasaktiveerimine CS-ga uuesti kokku puutudes algatab nii taaskonsolideerimise kui ka väljasuremise; lühike (3 minutit) uuesti kokkupuude konditsioneeritud kontekstiga kutsub esile taaskonsolidatsiooni, samas kui pikk (30 minutit) või korduv kokkupuude selles kontekstis kutsub esile väljasuremise (Eisenberg et al., 2003; Pedreira ja Maldonado, 2003; Suzuki et al., 2004; Lee jt, 2008; Mamiya jt, 2009). Lisaks leidsime, et allalaaditud IA-mälu täiustatakse selle ülesande mälu uuesti konsolideerimise kaudu (Fukushima et al., 2014).

Et mõista mehhanismi üleminekuks taaskonsolideerimiselt väljasuremiselehirmumälu taastamine, püüdsime tuvastada ja iseloomustada IA ​​mälu taaskonsolideerimise, ülemineku ja väljasuremise faasi molekulaarseid, rakulisi ja käitumuslikke allkirju. Analüüsisime CREB ja ERK aktiveerimist amügdalas, hipokampuses ja mPFC-s taaskonsolideerimise, ülemineku ja väljasuremise faasis ning uurisime ERK aktiveerimise rolli nendes mäluprotsessides.

Materjalid ja meetodid

Hiired Kõik katsed viidi läbi vastavalt laboriloomade hooldamise ja kasutamise juhendile (Jaapani Neuroscience Society ja Tokyo Põllumajandusülikool). Kõik selles uuringus tehtud loomkatsed kiitis heaks Tokyo Põllumajandusülikooli loomade hooldamise ja kasutamise komitee (luba nr 280037). Kõik kirurgilised protseduurid viidi läbi Nembutali anesteesia all ja tehti kõik endast olenev kannatuste minimeerimiseks. Isased C57BL/6N hiired saadi Charles Riverist. Hiiri hoiti viie- või kuueliikmelistes puurides, neid hoiti 12/12-tunnise valguse/pimeduse tsüklis ning neile võimaldati juurdepääs toidule ja veele ad libitum. Hiired olid testimisel vähemalt kaheksa nädala vanused. Testimine viidi läbi tsükli valgusfaasis. Kõik katsed viidi läbi pimedana hiirte ravitingimuste suhtes.

IA test IA astmeline aparaat (OHARA Pharmaceutical) koosnes kastist, millel oli eraldi heledad ja tumedad sektsioonid (mõlemad 15,5 12,5 11,5 cm). Valguse sektsioon valgustati fluorestseeruva valgusega (2500 luksi; Fukushima jt, 2008, 2014; Zhang jt, 2011; Ishikawa jt, 2016). Enne IA treeningu algust käideldi hiiri iga päev 2 minutit ühe nädala jooksul individuaalselt. Treeningu ajal lasti igal hiirel 30 sekundit valguskambriga harjuda ja giljotiini uks tõsteti üles, et võimaldada juurdepääsu pimedasse sektsiooni. Omandamise mõõduks peeti pimedasse sektsiooni sisenemise latentsust. Niipea kui hiir oli pimedasse kambrisse sisenenud, suleti giljotiini uks. 5 sekundi pärast anti jalalöök (0,2 mA) kokku 2 sekundiks (treening). 24 tundi pärast treeningut pandi hiir tagasi heledasse kambrisse, kuni see sisenes pimedasse kambrisse (keskmine 459 6 15,49 s). Kohe pärast hiire sisenemist pimedasse kambrisse suleti giljotiini uks ja hiir viibis pimedas kambris erineva aja jooksul (0, 1 või 10 minutit) ilma jalalöögita (taasaktiveerimine). Mälu hinnati 48 tundi hiljem [reaktivatsioonijärgne pikaajaline mälu (PR-LTM) test] kui hiire ülemineku latentsusaeg pimedasse kambrisse, kui see asetati heledasse kambrisse, nagu taasaktiveerimisel.

Esimeses katses uurisime valgusünteesi inhibeerimise mõju pärast taasaktiveerimist (taas eksponeerimine pimedasse sektsiooni 0, 1 või 10 minutiks; joonis 1). Valgusünteesi inhibiitor anisomütsiin (ANI; Wako) lahustati soolalahuses (pH reguleeriti NaOH-ga 7.{12}}–7,4). Hiiri treeniti ülalkirjeldatud viisil ja 24 tundi hiljem said nad vehiikulit (VEH) või ANI-d (150 mg/kg, ip) kohe pärast uuesti pimedasse kambrisse 0, 1 või 10 minutiks kokkupuudet ilma jalalöögita. (taasaktiveerimine). Selle annuse korral inhibeerib ANI esimese 2 tunni jooksul 0,90 protsenti valkude sünteesist ajus (Flood et al., 1973). 48 tundi pärast taasaktiveerimisseanssi asetati üksikud hiired taas valguskambrisse ja hinnati ristumise latentsust.

Teise katse jaoks [fosforüülitud CREB (pCREB) ja fosforüülitud ERK (pERK) immunohistokeemia; joonised fig. 2–5], uurisime ajupiirkondi, mis aktiveerusid pärast uuesti kokkupuudet valgusega (kuni hiired sisenesid pimedasse kambrisse, uuesti kokkupuude pimedasse sektsiooni 0 min) või pimedasse sektsiooni (taas- kokkupuude pimedas kambris 1 või 1 0 min). Hiired jagati neljaks Fukushima jt. · Hirmumälu faaside üleminek pärast otsimist J. Neurosci., 10. veebruar 2021, • 41(6):1288–1300 • 1289rühma. 24 tundi pärast treeningut eksponeeriti üksikud hiired uuesti valguskambrisse ja jäädi seejärel pimedasse kambrisse pärast nende sisenemist pimedast kambrist [taasaktiveerimine: 0 min pimedas kambris, taaskonsolidatsiooni (Recon) rühm; 1 min, ülemineku (Tran) rühm; 10 min, ekstinktsiooni (Ext) rühm]. Teist hiirte rühma ei viidud tagasi heledasse/pimedasse sektsiooni [mitte-reaktiveeritud (NR) rühm]. Seejärel anesteseeriti hiired Nembutaliga (750 mg/kg, ip) 5, 15 või 30 minutit pärast taasaktiveerimist.

Kolmanda katse jaoks (U{{20}}126 mikroinfusioon; joonised 6, 7) uurisime ERK inhibeerimise mõju mandelkehas, hipokampuses või mPFC-s mälu taastamisest/täiendamisest, üleminekust, ja väljasuremine. MEK inhibiitor U0126 (Sigma-Aldrich) lahustati kunstlikus tserebrospinaalvedelikus, mis sisaldas kolme tilka Tween 80 (Sigma) 2,5 ml 7,5-protsendilises dimetüülsulfoksiidis (Wako), ja reguleeriti pH väärtuseni. 7,4 NaOH-ga. Hiiri treeniti ülalkirjeldatud viisil ja 24 tundi hiljem pandi nad tagasi valguskambrisse (taasaktiveerimine). Hiirtele mikroinfundeeriti U0126 (1 mg) või VEH erinevatesse ajupiirkondadesse kohe pärast (joonised 6A, C, E-H, 7A-C) või 30 minutit pärast (joonis 6B, D) taasaktiveerimist. 48 tundi pärast taasaktiveerimist asetati üksikud hiired taas valguskambrisse ja hinnati ristumise latentsust (PR LTM). Mikroinfusioonid hipokampusesse ja mPFC (0,5 ml) tehti kiirusega 0,25 ml/min. Mikroinfusioonid amygdalasse (0,2 ml) tehti kiirusega 0,1 ml/min. Süstekanüül jäeti pärast mikroinfusiooni 2 minutiks oma kohale ja hiired viidi seejärel tagasi oma kodupuuri. MEK inhibiitor SL327 (Santa Cruz Biotechnology) lahustati dimetüülsulfoksiidis ja lahjendati soolalahusega. Hiiri treeniti ülalkirjeldatud viisil ja 24 tundi hiljem pandi üksikud hiired tagasi valguskambrisse (taasaktiveerimine). Hiirtele süstiti süsteemselt SL327 (10 või 20 mg/kg) või VEH kohe pärast taasaktiveerimist (joonis 7D–F). 48 tundi pärast taasaktiveerimist asetati üksikud hiired uuesti valguskambrisse ja hinnati ristumise latentsust (PR-LTM).

Immunohistokeemia viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud (Mamiya et al., 2009; Suzuki jt, 2011; Zhang jt, 2011; Fukushima jt, 2014; Ishikawa jt, 2016; Hasegawa jt, 2019). Pärast tuimastamist perfuseeriti kõik hiired 4% paraformaldehüüdiga. Ajud eemaldati, fikseeriti üleöö, viidi 30-protsendilisele sahharoosile ja säilitati 4 kraadi juures. Koronaalsed lõigud (30 mm) lõigati krüostaadis.

pCREB ja pERK värvimiseks töödeldi vabalt hõljuvaid sektsioone 1 protsendi H2O2-ga ja inkubeeriti üleöö küüliku polüklonaalse anti-fosfo-CREB (seriin 133; S133) antikehaga (1:1000; #{{10). }}, Millipore) ja/või küüliku monoklonaalne anti-fosfo-ERK1/2 (T202/Y204) antikeha (1:300; #4370; Cell Signaling Technology) blokeerivas lahuses (fosfaatpuhverdatud soolalahus pluss 1% kitse seerumi albumiini, 1 mg/ml veise seerumi albumiini ja 0,05 protsenti Triton X-100). Sektsioone pesti fosfaatpuhverdatud soolalahusega ja inkubeeriti mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud eesli küülikuvastase IgG-ga (1:500; Jackson ImmunoResearch) pCREB jaoks või mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud kitse küülikuvastase IgG-ga pERK jaoks 1 tund toatemperatuuril. pCREB signaale võimendati biotiintüramiidiga ja visualiseeriti Alexa Fluor-konjugeeritud streptavidiini (Invitrogen) abil. pERK signaale võimendati TSA-FCM-iga (Invitrogen). Sektsioonid paigaldati slaididele ja kaeti kinnitusvahendiga (Millipore) katteklaasiga.

Kvantifitseerimine viidi läbi vastavalt eelnevalt kirjeldatule (Frankland jt, 2006; Fukushima jt, 2014; Mamiya jt, 2009; Zhang jt, 2011; Suzuki et al., 2008). Struktuurid määrati anatoomiliselt vastavalt Franklini ja Paxinose atlasele (1997). Kõik immunoreaktiivsed neuronid loendas raviseisundi suhtes pimeda eksperimenteerija

Tulemused

Mälufaaside iseloomustus pärast otsimist IA ülesandes

IA ülesanne võimaldab meil eristada taasühendamise ja väljasuremise faase ajal, mil hiir siseneb heledast kambrist pimedasse kambrisse (Fukushima et al., 2014). Mälufaaside taaskonsolideerimiselt väljasuremisele ülemineku mehhanismi mõistmiseks iseloomustasime mälu otsimisele järgnevaid IA-mälu faase, uurides IA-mälu taaskonsolideerimiseks ja väljasuremiseks vajaliku valgusünteesi pärssimise mõju (Fukushima et al., 2014). Hiired paigutati esmalt valguskambrisse. 5 sekundit pärast pimedasse kambrisse sisenemist tehti lühike elektriline jalalöök (treening). Hiired eksponeeriti uuesti valguskambrisse 24 tundi pärast treeningut (taasaktiveerimisseanss; joonis 1A) ja hinnati nende pimedasse sektsiooni sisenemise ristumislatentsi (joonis 1B). Hiired viidi tagasi oma kodupuuridesse kohe pärast seda, kui nad sisenesid heledast kambrist pimedasse kambrisse (0-min uuesti kokkupuude pimedas kambris; taaskasutusfaas) või jäeti pimedasse kambrisse 1, 3 või 10 minutit ilma jalalöögi saamata (väljasuremisfaas; joon. 1C–E). Vahetult pärast taasaktiveerimisseanssi said hiired süsteemse VEH-i või valgusünteesi inhibiitori ANI süsti. 48 tundi hiljem hinnati ristumise latentsust PR-LTM.

Kooskõlas meie eelmise uuringuga (Fukushima et al., 2014) kutsus valguskambri korduv kokkupuude (0 min rühm) esile IA mälu taaskonsolideerimise ja täiustamise. Kahesuunaline ANOVA näitas aja (F(1,24)=10.433, p=0.{{20}}036), ravimi (F(1) olulisi mõjusid ,24)=23.197, p , 0,0001) ja ravimite koostoime aeg (F(1,24)=25.022, p , 0,0001; joonis 1B). Post hoc Bonferroni test ja paaris t-test näitasid, et VEH- ja ANI-rühmadel oli vastavalt PR-LTM-i ristumislatentsus oluliselt suurenenud või vähenenud, võrreldes taasaktiveerimisseansiga (ps , 0,05; VEH, t(6) {{28 }} 5.134, p=0.0021, ANI, t(6)=4.804, p=0.003; joonis 1B). Need tähelepanekud näitavad, et IA-mälu otsimine valguskambris suurendas mälu, samas kui valgusünteesi pärssimine häiris leitud mälu, kinnitades varasemat tähelepanekut, et IA-mälu taastamine suurendab mälu valgusünteesist sõltuval viisil konsolideerimise kaudu.

Seevastu uuesti kokkupuude pimedas sektsioonis kutsus esile pikaajalise väljasuremise [kahesuunaline ANOVA, aeg (joonis 1C, F(1,28)=9.575, p=0). {50}}04; joonis 1D, F(1,36)=11.699, p=0.0016), ravim (joonis 1C, F(1,28)=4.674, p=0.039; joonis 1D, F(1,36)=12.285, p {{29 }},0012), ravimite koostoime aeg (joonis 1C, F(1,28)=7,916, p=0,009; joonis 1D, F(1,36) {{41 }}.915, p=0.0079)], nagu varem täheldatud (Fukushima et al., 2014). VEH rühmad, kes jäid pimedasse sektsiooni 3 või 10 minutiks, näitasid PR-LTM-i ristlatentsust oluliselt vähenenud võrreldes taasaktiveerimisseansiga, samas kui ANI rühmad näitasid PR-LTM-is võrreldavat ristlatentsust võrreldes taasaktiveerimisseansi ja VEH rühmad (post hoc Bonferroni test, ps , 0,05; paaris t test, joonis 1C, VEH, t(7)=4.976, p=0.0016, ANI, t(7) { {59}}.796, lk 0,05; joonis 1D, VEH, t(9)=10.211, p , 0,0001, ANI, t(9)=1,02, lk 0,05 ). Need tähelepanekud näitavad, et uuesti kokkupuude pimedas kambris 3 või 10 minuti jooksul kustutas IA mälu ja valgusünteesi pärssimine blokeeris pikaajalise väljasuremise. Seega kustutab IA mälu otsimine pimedas sektsioonis IA mälu geeniekspressioonist sõltuval viisil.

Oluline on see, et VEH rühm näitas PR-LTM-i puhul võrreldavat latentsusaega võrreldes taasaktiveerimisseansi ja ANI rühmaga, kui nad viibisid pimedas kambris 1 minuti [kahesuunaline ANOVA, aeg (F(1,36) {{ 5}}.03, lk 0.05), ravim (F(1,36)=0.019, lk . 0.05), ravimite koostoime aeg (F(1,36)=0,011, p . 0,05); post hoc Bonferroni test, ps . 0,05; paaris t-test, VEH, t(9)=0.091, lk . 0,05, ANI, t(9)=0.328, lk . 0,05; joonis fig 1E]. Need tähelepanekud näitavad, et VEH-rühmas ei ilmnenud IA-mälu paranemist ega väljasuremist ning ANI-rühmas ei ilmnenud IA-mälu häireid. Seetõttu blokeeris 1-minutiline pimedas kambris taassäritamine nii taasaktiveeritud IA-mälu täiustamise kui ka ANI-indutseeritud häired, kuid mitte kustutatud IA-mälu, mis viitab sellele, et see 1-minutiline kordussäritus tühistab taasühendamise indutseerimise. , kuid sellest ei piisa IA mälu kustutamiseks.

Kokkuvõttes näitasid need tulemused, et valguskambri korduv kokkupuude kutsub esile taaskonsolideerimisfaasi, samas kui pikem kokkupuude pimedas kambris (3 või 10 minutit) kutsub esile väljasuremisfaasi. Veelgi olulisem on see, et 1-minutiline pimedas kambris viibimine kutsub esile üleminekufaasi taaskonsolideerimisest väljasuremiseni, mis pärsib hirmumälu taastamist, põhjustamata väljasuremist.

Amygdala, hipokampuse ja mPFC taasühendamise, ülemineku ja väljasuremise faaside molekulaarsed signatuurid pärast IA mälu otsimist

Kontekstuaalse hirmumälu taastamine ja väljasuremine näitab CREB fosforüülimise suurenemist S133 juures, mis on taaskonsolideerimiseks ja pikaajaliseks väljasuremiseks vajalik geeniekspressiooni aktiveerimise marker, kuid näitab CREB fosforüülimise selget dünaamikat (Mamiya et al., 2009). ). Huvitaval kombel on hiljutised uuringud näidanud, et CREB-i ülesvoolu regulaatori ERK fosforüülimine (Impey et al., 1998; Wu et al., 2001) mandelkeha basolateraalses piirkonnas taaskonsolidatsioonist üleminekul ei suurene. vihjatud hirmumälu väljasuremiseni, kuigi see fosforüülimine suureneb basolateraalses piirkonnas, kui vihjatud hirmumälu taas konsolideeritakse ja kustub (Merlo et al., 2014, 2018). Teine uuring näitas, et hipokampuse ERK aktiveerub ainult siis, kui kontekstuaalne hirmumälu kustub, kuid seda ei konsolideerita uuesti (Tronson et al., 2009). Need leiud viitavad sellele, et rekonsolidatsiooni-, ülemineku- ja väljasuremisfaasid näitavad erinevaid molekulaarseid ja rakulisi allkirju. Seetõttu mõõtsime ja võrdlesime immunohistokeemia abil pCREB ja pERK taset rekonsolidatsiooni-, ülemineku- ja ekstinktsioonifaasis. Tegime nelja katserühma abil sarnaseid katsegraafikuid nagu joonisel 1B, D, E. Hiired viidi uuesti valguskambrisse 24 tundi pärast treeningut ja jäeti seejärel pimedasse kambrisse [taasaktiveerimine: 0 min pimedas kambris, taaskonsolidatsiooni (Recon) rühm; 1 min, ülemineku (Tran) rühm; 10 min, ekstinktsiooni (Ext) rühm]. Teist hiirte rühma ei viidud tagasi heledasse/pimedasse sektsiooni (taasaktiveerimata, NR-rühm). 30 minutit pärast taasaktiveerimisseanssi loendasime mandelkehas, hipokampuses ja mPFC-s pCREB-positiivsed (pCREB1) neuronid, pERK-positiivsed (pERK1) neuronid ja topeltpositiivsed (pCREB1/pERK1) neuronid.

Amygdala (külgmine piirkond) CREB aktiveeriti väljasuremis- ja taaskonsolideerimisfaasis, samas kui ERK aktiveeriti ainult väljasuremisfaasis (joonis 2-C). Ühesuunaline ANOVA näitas rühma olulist mõju (joonis 2B, F(3,29)=14.85, p , 0.0001). Sarnaselt varasematele leidudele (Mamiya et al., 2009) näitas post hoc Newman-Keulsi test, et Recon ja Ext rühmad näitasid oluliselt rohkem pCREB1 neuroneid kui teised rühmad (p, 0,05). Need tähelepanekud näitasid, et sarnaselt käitumistasemete vaatlustele (joonis 1) tühistab 1-minutise pimedas sektsioonis viibimine (üleminekufaas) CREB-i fosforüülimise "sisselülitamise", mis taaskonsolideerimisfaasis suureneb. Seevastu Ext rühmas täheldati oluliselt rohkem pERK1 neuroneid kui teistes rühmades, kuigi pERK1 neuroneid oli palju vähem kui pCREB1 neuroneid Ext rühmas (F(3,29)=3.793, p { {23}}.0207; joonis 2C).

Järjekindlalt täheldati Ext rühmas oluliselt rohkem topeltpositiivseid neuroneid (pCREB1/pERK1) (F(3,29)=6.698, p=0.00 14; joonis 2D), samas kui rühmades Recon ja Ext täheldati oluliselt rohkem pCREB1/pERK– (pCREB üksikpositiivseid) neuroneid (F(3,29)=13.689, p , 0 .0001; joonis 2E). Seega näitas taaskonsolideerimisfaas ainult ühte pCREB1 / pERK- neuronite populatsiooni. Seevastu ekstinktsioonifaas näitas kahte pCREB1 / pERK- ja pCREB1 / pERK1 neuronite populatsiooni, mis näitab, et ERK aktiveeritakse ainult pCREB1 neuronite alamhulgas. Oluline on see, et sarnaseid tulemusi täheldati mandelkeha basolateraalses piirkonnas (joonis 2G, F(3,29)=13.042, p , 0,0001; joonis 2H, F(3,29) {{32} }.824, p=0.0201; joonis 2I, F(3,29)=12.633, p , 0,0001; joonis 2J, F(3,29)=12 .505, p , 0,0001).

ERK kahefaasiline aktiveerimine väljasuremisfaasis ERK on CREB-i ülesvoolu aktivaator ja seetõttu on ERK aktiveerimine vajalik hirmumälu konsolideerimiseks ja taaskonsolideerimiseks (Schafe et al., 200{{31). }}; Duvarci et al., 2005). Kuid ebajärjekindlalt ei täheldatud ERK aktiveerimist mandelkehas, hipokampuses ega mPFC-s taaskonsolidatsioonifaasis, kui pERK mõõdeti 30 min pärast taasaktiveerimisseanssi (joonised 2-4). Seetõttu uurisime ERK ja CREB fosforüülimise ajakulu. Tegime sarnase katse nagu joonistel 2-4, välja arvatud see, et pCREB ja pERK tasemeid mõõdeti 5, 15 ja 30 min pärast taasaktiveerimisseanssi (taaskokkupuude pimedas kambris {{ 66}}, 1 või 10 min; joonis 5A). Kooskõlas joonistel 2-4 näidatud andmetega täheldati pCREB1 neuronite arvu olulist suurenemist 30 minuti pärast, kuid mitte 5 minuti pärast pärast taasaktiveerimisseanssi Reconis (amügdala, mPFC ja hipokampus) ja Ext'is (amügdala ja mPFC). ) rühmad, kuid mitte Tran rühm (joonis 5E, ühesuunaline ANOVA, amügdala, 5 min, F(3,23)=0.346, p . 0,05, 30 min, F(3,23)=15.272, p, 0,0001; mPFC, 5 min, F(3,23)=1,169, p 0,05, 30 min, F(3,23)=32. 346, p, 0,0001, hipokampus, 5 min, F(3,23)=0,154, p 0,05, 30 min, F(3,23)=16,197, p, 0,0001; paaritu t-test, amügdala, taaskonsolidatsioon, 5 vs 30 min, t(12)=7.807, p , 0,0001, ekstinktsioon, 5 vs 30 min, t(12)=5.405, p { {73}}.0002; mPFC, taaskonsolideerimine, 5 vs 30 min, t(12)=5,727, p , 0,0001, ekstinktsioon, 5 vs 30 min, t(12)=4.188 , p=0.0013; hipokampuse CA1 piirkond, taaskonsolideerimine, 5 vs 30 min, t(12)=2.339, p=0.0374).

Huvitaval kombel täheldati Recon, Tran ja Ext rühmade mandelkehas, mPFC-s ja hipokampuses pERK1 neuronite arvu olulist suurenemist 5 minutit pärast taasaktiveerimisseanssi võrreldes NR-rühmaga (joonis 5F, amügdala, F(3,23)).=10.961, p=0.0001; mPFC, F(3,23)=7.525, p { {13}}.0011; hipokampus, F(3,23)=6.924, p=0.0017). Need tähelepanekud näitasid, et ERK aktiveeritakse kohe pärast taasaktiveerimisseanssi kõigis mälufaasides. Kuid need pERK1 neuronite arvu suurenemised jõudsid 15 minuti jooksul pärast taasaktiveerimisseanssi tagasi baastasemele (võrreldavad NR-rühmaga) (joonis 5F, amügdala, F(3,20)=2.676, p). 0,05; mPFC, F(3,23)=0,683, lk 0,05; hipokampus, F(3,20)=0,74, p 0,05). Veelgi enam, kooskõlas joonistel 2-4 näidatud leidudega täheldati ainult Ext rühmas mandelkehas, mPFC-s ja hipokampuses oluliselt rohkem pERK1 neuroneid 30 minutit pärast taasaktiveerimisseanssi (joonis 5F, amügdala, F(). 3,23)=6.616, p=0.022; mPFC, F(3,23)=8.012, p=0.0008; hipokampus, F( 3,23)=6.206, p=0.003). Seega näitavad rekonsolidatsiooni- ja üleminekufaasid ERK mööduvat aktiveerimist ainult varasel ajahetkel (5 minutit), samas kui väljasuremise faas näitab ERK kahefaasilist aktiveerimist varasel (5 minutit) ja hilisel (30 minutit) ajahetkel pärast taasaktiveerimist. istungil. Need tähelepanekud näitasid, et ERK aktiveerimise reguleerimise mehhanismid erinevad taaskonsolideerimis- / ülemineku- ja väljasuremisfaasis. Kokkuvõttes näitasid meie tähelepanekud, et rekonsolidatsiooni-, ülemineku- ja väljasuremisfaasidel on erinevad molekulaarsed allkirjad.

ERK aktiveerimise rollid IA mälu taaskonsolideerimise ja väljasuremise faasis

Taaskonsolideerimise / ülemineku ja väljasuremise faasid näitasid vastavalt ühefaasilist ja kahefaasilist ERK aktivatsiooni. Järgmisena uurisime ja võrdlesime varajase (5 min) ja hilise (30 min) ERK aktiveerimise rolli mPFC-s taaskonsolideerimise ja väljasuremise faasis, uurides ERK inhibeerimise mõju (joonis 6).

Arutelu

Selles uuringus uurisime mehhanisme mälu üleminekuks taaskonsolideerimisest väljasuremisfaasidesse pärast IA mälu otsimist. Esmalt iseloomustasime pärast otsimist IA mälufaaside käitumuslikke allkirju. Kooskõlas meie eelmise uuringuga (Fukushima et al., 2014) põhjustas IA mälu taastamisest tingitud taaskasutamine ja väljasuremine valguse (0 min pimedas kambris) ja pimeduse ( vastavalt 3 või 10 min) sektsioonidesse. Huvitav on see, et IA-mälu ei suurenenud ega kustunud ning näitas vastupanuvõimet valgusünteesi pärssimisele, kui hiired eksponeeriti uuesti pimedasse kambrisse vaid 1 minutiks. Seetõttu viitavad need tähelepanekud sellele, et 1-minutiline uuesti kokkupuude pimedas sektsioonis tühistab taaskonsolideerimise esilekutsumise, kuid sellest ei piisa IA-mälu kustutamiseks. Lisaks leidsime, et ERK aktiveerus amügdalas, hipokampuses ja mPFC-s varajases ajahetkes (5 minutit) pärast uuesti kokkupuudet pimedas kambris 0, 1 või 10 minutit. Järjekindlalt blokeeris ERK pärssimine nendes ajupiirkondades IA-mälu taastamise / suurendamise ja väljasuremise. Kõige tähtsam on see, et ERK inhibeerimine mandelkehas, hipokampuses ja mPFC-s pärast 1-minutilist pimedas sektsioonis uuesti kokkupuudet pärssis IA mälu taaskonsolideerimise vahendatud paranemist, mis viitab sellele, et ERK aktiveerimine pärast lühikest (1-minutilist) uuesti kokkupuudet pimedasse kambrisse on vajalik IA mälu taaskonsolideerimise pärssimine. Seevastu 1-minutisest pimedas sektsioonis taassäritusest ei piisanud IA-mälu kustutamiseks, kuigi pikenenud taassäritus pimedasse sektsiooni (3 või 10 minutit) kustutas selle mälu. Seetõttu viitavad meie tulemused sellele, et 1-minine korduv kokkupuude pimedas sektsioonis kutsub esile mälu üleminekuprotsessi, mis tühistab taaskonsolideerimise/täiustamise, kuid ei algata väljasuremise õppimist. Ühiselt soovitame, et mälu üleminekuprotsess aitab ERK-vahendatud taaskonsolideerimise ennetamise kaudu kaasa mälufaaside ümberlülitamisele taaskonsolideerimiselt väljasuremisele.

Sarnaselt meie praegustele tähelepanekutele näitas hiljutine kuulmishirmu konditsioneerimist kasutav uuring, et üksikud (1) või pikaajalised (10) CS-esitlused kutsuvad esile vastavalt mälu taastumise ja väljasuremise, suurendades pERK taset amygdala basolateraalses piirkonnas. Seevastu vahepealsed (4–7) CS-esitlused ei muuda pERK taset amygdala basolateraalses piirkonnas. Oluline on see, et ERK inhibeerimine vahepealsete CS-esitluste ajal ei mõjutanud hirmumälu. See uuring näitas, et pärast hirmumälu otsimist toimub mälufaasi üleminek taaskonsolideerimisest väljasuremiseni (Merlo et al., 2018). Käesolevas uuringus laiendasime seda järeldust ja tegime ettepaneku, et üleminekufaas lülitab ERK signaali ülekanderaja aktiveerimise kaudu aktiivselt mälufaase ümberkonsolideerimisest väljasuremiseni. Erinevalt varasematest leidudest (Merlo et al., 2018) leidsime, et üleminekufaas hõlmab ERK fosforüülimist amügdalas, hipokampuses ja mPFC-s. Need lahknevused võivad olla tingitud ERK fosforüülimist uurivate ajapunktide erinevusest; Eelmises uuringus mõõdeti pERK taset 12 minutit pärast CS-i esitlust (Merlo et al., 2018), samas kui meie uuring näitas, et suurenenud pERK tase naasis sellel ajahetkel (15 minutit pärast uuesti kokkupuudet) algtasemele. Lisaks on oluline märkida, et IA-ülesanne võimaldab jälgida IA-mälu paranemist taaskonsolideerimise kaudu, mis viib meie järelduseni, et ERK-i pärssimine üleminekufaasis pärsib IA-mälu paranemist.

Varasemad uuringud on näidanud, et ERK fosforüülimine suureneb mandelkeha basolateraalses piirkonnas 20–60 minuti jooksul pärast hirmumälu väljasuremise õppimist (Herry et al., 2006; Merlo jt, 2014, 2018), samas kui hipokampus näitab see aktiveerimine 1 tund pärast kontekstuaalse hirmumälu väljasuremise õppimist (Fischer et al., 2007; Tronson et al., 2009). Käesolevas uuringus saime sarnaseid tähelepanekuid, et pERK suureneb 30 minutit pärast väljasuremisfaasi taasaktiveerimisseanssi. Need leiud viitavad sellele, et ERK fosforüülimine on hilise ekstinktsioonifaasi (20–60 min) tavaline molekulaarne signatuur.

Lisaks täheldasime, et ERK aktiveerimine toimub kahefaasiliselt varases ja hilises ajapunktis (5 ja 30 minutit) pärast taasaktiveerimisseanssi ekstinktsioonifaasis, samas kui see aktiveerimine toimub monofaasiliselt taaskonsolideerimisfaasi varajases ajapunktis (joonis 5). . Järjekindlalt blokeeris ERK pärssimine ajupiirkondades nendel taaskonsolideerimis- ja väljasuremisfaaside ajahetkedel vastavalt rekonsolideerimise / suurendamise ja pikaajalise väljasuremise (joonis 6, C-H). Need tähelepanekud viitavad sellele, et IA mälu taaskonsolideerimise vahendatud täiustamiseks ja väljasuremiseks on vaja vastavalt ühefaasilist ja kahefaasilist ERK aktiveerimist. Oluline on märkida, et ERK toimib CREB fosforüülimise ülesvoolu regulaatorina. Seetõttu võib ERK mööduv aktiveerimine varases mälufaasis vähemalt osaliselt kaasa aidata CREB-i fosforüülimisele, mis aktiveerib taaskonsolideerimiseks ja pikaajaliseks väljasuremiseks vajalike geenide ekspressiooni.

Sarnaselt meie varasematele leidudele, kasutades kontekstuaalset hirmu konditsioneerimist (Mamiya et al., 2009), aktiveeriti CREB taaskonsolideerimise (amügdala / hipokampus / mPFC) ja väljasuremise (amygdala / mPFC) mälufaasis, samas kui ERK aktiveeriti ainult väljasuremisfaasis. 30 minutit pärast taasaktiveerimisseanssi. Järjekindlalt täheldati taaskonsolidatsioonifaasis ainult ühte pCREB1/pERK-neuronite populatsiooni, samas kui väljasuremisfaasis täheldati erinevaid neuronipopulatsioone: pCREB1/pERK- ja pCREB1/pERK1 neuronid amügdalas (joonis 2); pCREB- /pERK1 neuronid hipokampuses (joonis 3); ja pCREB1/pERK–, pCREB–/pERK1 ja pCREB1/pERK1 neuronid mPFC-s (joonis 4). Need tähelepanekud, eriti pCREB-/pERK1 ja pCREB1/pERK- neuronite vastandlikud vaatlused, viitavad sellele, et CREB-i ja ERK-i aktiveerimist reguleeritakse igas ajupiirkonnas erinevalt, kui mälu kustub, ja et ERK-i hilise faasi aktiveerimine mängib spetsiifilist ja selgelt eristuvat. rollid hirmumälu väljasuremisel võrreldes teiste mäluprotsessidega, nagu konsolideerimine ja taaskonsolideerimine, nagu allpool käsitletud. Huvitaval kombel täheldasime, et pERK1 neuroneid oli mPFC-s rohkem kui hipokampuses ja mandelkehas, kuna mPFC näitas pERK1 neuronite (väljasuremisfaas) ja pCREB1 neuronite (rekonsolidatsioonifaas) suuremat suhet võrreldes hipokampuse ja amygdalaga, mis viitab sellele, et ERK aktiveerimine mPFC-s mängib mälu väljasuremisel spetsiifilisemat rolli.

Jääb ebaselgeks, kas taaskonsolideerimise, ülemineku ja väljasuremise mälufaasis aktiveeritakse samad või erinevad neuronite populatsioonid. Eelmises uuringus tuvastati "hirmuneuronite" ja "väljasuremisneuronite" aktiveerimine mandelkehas, kui hirmumälu vastavalt taasaktiveeritakse või kustub (Herry et al., 2008). Seetõttu on võimalik, et ERK ja CREB aktiveeruvad erineva ajalise profiiliga neuronite erinevates populatsioonides (st "taaskonsolideerimisneuronites" ja väljasuremisneuronites). Nagu ülalpool arutatud, võivad pCREB1 neuronid, sealhulgas pCREB1 / pERK1 neuronid, reguleerida IA ​​mälu taaskonsolideerimist ja pikaajalist väljasuremist, aktiveerides geeniekspressiooni vastavalt rekonsolidatsiooni- ja väljasuremisneuronitena. Vastupidi, ERK aktiveerimine pCREB- / pERK1 neuronites võib aidata kaasa CREB-vahendatud transkriptsioonilise aktivatsiooni tühistamisele, mis oleks vajalik taaskonsolideerimiseks, kuna seda ERK aktiveerimist täheldatakse konkreetselt hilises väljasuremisfaasis; ERK on aktiveeritud taaskonsolideerimisneuronites, et tühistada geeniekspressiooni aktiveerimine väljasuremisfaasis. Huvitaval kombel näitas eelmine uuring, et hipokampuse ERK aktiveerimine blokeerib c-fos indutseerimise, kui kontekstuaalne hirmumälu kustub (Guedea et al., 2011), suurendades võimalust, et see ERK aktiveerimine antagoniseerib CREB-signaali rada. Oluline on tuvastada neuronite populatsioonid, mis reguleerivad taaskonsolideerimist, üleminekut ja väljasuremist, ning uurida nende neuronite molekulaarseid allkirju ja funktsionaalset tähtsust. Lisaks on selles uuringus tuvastatud närvipopulatsioonide vahelised interaktsioonid teadmata. On võimalik, et "väljasuremise (ülemineku) neuronid" moduleerivad taaskonsolidatsioonineuronite funktsiooni, et takistada taaskonsolideerimist nendevaheliste interaktsioonide kaudu (Eisenberg et al., 2003; Merlo et al., 2014). Seetõttu on samuti oluline uurida neid koostoimeid mandelkehas, mPFC-s ja hipokampuses ning nende vahel.

Varem näitasime, et hipokampuses ei ole pärast kontekstuaalse hirmu väljasuremise õppimist CREB fosforüülimise ja kaare ekspressiooni muutusi ning järjekindlalt ei suuda valgu sünteesi pärssimine hipokampuses väljasuremisfaasis pikaajalist väljasuremist blokeerida (Mamiya et al. , 2009). Need tähelepanekud on tõstatanud võimaluse, et hipokampus ei ole pikaajaliseks väljasuremiseks vajalik. Siiski näitasime, et ERK aktiveeritakse hipokampuses pärast IA mälu väljasuremise õppimist ja järjekindlalt kahjustab ERK aktiveerimise blokeerimine hipokampuses pikaajalist väljasuremist. Seetõttu näitavad meie praegused tähelepanekud hipokampuse olulist rolli mälu väljasuremisel. Koos meie varasemate leidudega soovitame, et hipokampus on vajalik mälu väljasuremiseks, kuid mitte konsolideerumistaoliseks protsessiks, mis stabiliseerib "väljasuremismälu" geeniekspressiooni aktiveerimise kaudu.