Uudne S-sulfhüdreeritud inimese seerumi albumiini preparaat pärsib melaniini sünteesi

Kontakt:jaslyn.ji@wecistanche.com

Inimese seerumi albumiin (HSA) on seerumis kõige rikkalikum valk ja seda kasutatakse laialdaselt ravimikandjana selle biosobivuse ja pika plasmapeetuse omaduste tõttu [14,15]. HSA sisaldab kokku 35 Cys jääki ja üks neist, Cys34, esineb vaba tioolrühma kujul [16]. Cys34 on mõnikord oma reaktiivse tioolrühma tõttu ravimi sidumissaidi sihtmärk [17, 18]. Näiteks lämmastikoksiidi (NO) juuresolekul on Cys34 tioolrühm S-nitroseeritud. Varem näitasime, et S-nitroositud HSA (SNO-HSA) võimaldab NO-d seerumis pikka aega säilitada [19]. SNO-HSA-l on erinevad bioloogilised funktsioonid, sealhulgas maksa kaitsev toime isheemia/reperfusiooni vastu [20] ja kasvajat pärssiv toime [21].

Sellest tulenevalt püstitasime hüpoteesi, et HSA-d saab kasutada RSS-i kandjana (nagu SNO-HSA) Cys34-SH S-sulfhüdratsiooni kaudu. Polüväävli allikana on DATS ja DMTS piiratud nende lipofiilsuse ja lenduvuse tõttu. Seetõttu kasutati selles uuringus kaubanduslikult saadavat Na2Sn (Na2S, Na2S2, Na2S3 ja Na2S4). Ogasawara et al. eelnevalt valmistatud väävliga seotud seerumi albumiin, mis reageeris naatriumsulfiidiga (NaHS) reaktiivide lihtsal segamisel [22]. Cys34-le lisati NaHS väävel ja saadud preparaat kaitses lipiidperoksiidi põhjustatud maksakahjustusi. Võtsime selle meetodi kasutusele RSS-i lisatud HSA ettevalmistamiseks, kasutades RSS-i edastamiseks Na2Sn.

Selles töös kirjeldasime Na2Sn-ga töödeldud HSA valmistamist ja selle kasutamist uudse RSS-i kohaletoimetamissüsteemina. Lisatud väävlit analüüsiti sulfaani väävlisondi [23] ja sulfiidi eemaldamise abil polüsulfiidist [24]. Et hinnata Na2Sn-ga töödeldud HSA mõju naha valgendamisele, uuriti Na2Sn-ga töödeldud HSA mõju melaniini sünteesile, kasutades B16 melanoomi rakuliini.

2. Materjal ja meetodid

2.1. Materjalid

Inimese seerumi albumiin (HSA) osteti ettevõttest KAKETSUKEN (Kumamoto, Jaapan) ja kõik HSA proovid rasvastati söe töötlemisega. Naatriumsulfiid ja naatriumtetrasulfiid osteti ettevõttest DOJINDO Laboratory (Kumamoto, Jaapan). Sulfaanväävli sond 4 (SSP4) valmistati eelnevalt kirjeldatud viisil [23]. L-DOPA, glutatioon (DTNB), askorbiinhape ja naatriumsatiiriline Griessi reaktiiv (sulfanilamiid, naftüleendiamiin-HCl) osteti ettevõttelt Nakarai Chemicals (Kyoto, Jaapan). Sephadex G-25 soolatustamiskolonn (φ 1,6 × 2,5 cm) osteti ettevõttelt GE Healthcare (Kyoto, Jaapan). Dulbecco modifitseeritud Eagle sööde (DMEM) ja 2,2-difenüül-1-pikrüülhüdrasüül (DPPH) saadi ettevõttest Wako Pure Chemical (Osaka, Jaapan). Seene türosinaas osteti firmalt Sigma-Aldrich. Kõik muud kemikaalid olid parima kvaliteediga, mis kaubanduslikult saadaval oli, ja kõik lahused valmistati deioniseeritud ja destilleeritud vees.

cistanche ekstrakt

2.2. BCA valgu analüüs

Valgu kontsentratsioone mõõdeti BCA valguanalüüsi abil. 10 µl proovide alikvoote ja veise seerumi albumiini (BSA) standardeid inkubeeriti 100 µl reaktsioonipuhvris 25 kraadi juures 30 minutit. Pärast reaktsiooni kasutati 540 nm neeldumise mõõtmiseks mikroplaadilugejat. Standardkõvera koostamiseks kasutati BSA-d.

2.3. Na2Sn-ga töödeldud HSA süntees

HSA-d (300 µM) inkubeeriti 1 mM naatriumpolüsulfiididega (Na2Sn) PBS-is (pH 7,4) 1 tund 37 kraadi juures. Pärast reaktsiooni eemaldati naatriumpolüsulfiidide liig geelfiltrimisega Sephadex G{8}} kolonnis.

2.4. Väävli sidumiskiiruse määramine polüsulfiidist sulfiidi (EMSP) eemaldamise meetodil

EMSP valmistati eelnevalt kirjeldatud viisil (3 × EMSP, lisades 792 mg L-askorbiinhapet 5 ml 3 N NaOH-le) [24]. Proove (7,5 μM, 133 μL) inkubeeriti 66,7 μL 3 × EMSP-ga 3 tundi 37 kraadi juures. Seejärel lisati reaktsioonilahusele 1-protsendiline tsinkatsetaadi lahus (600 µl), millele järgnes kohe segamine. Proove tsentrifuugiti kiirusel 8,000 × g 5 minutit ja pesti kaks korda fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS). Pärast supernatantide eemaldamist lisati sademetele deioniseeritud ja destilleeritud vett (200 μL). Pärast 1% tsinkatsetaadi (300 μL), 50 μL 20 mM N,N-dimetüül-p-fenüleendiamiini ja 20 mM FeCl3 lisamist 7,2 N HCl-s inkubeeriti lahust 30 minutit 25 kraadi juures. Proove tsentrifuugiti 8000 × g juures 1 minut ja kanti 96-süvendiga plaatidele ning mõõdeti OD 665 nm juures. Standardkõvera koostamiseks kasutati Na2S.

2.5. Sulfaanväävli tuvastamine SSP4 abil

Iga proovi (20 μM) inkubeeriti 5 μM SSP4-ga 1 mM tsetüültrimetüülammooniumbromiidis/PBS-is (pH 7,4) 10 minutit 25 kraadi juures. Pärast inkubeerimist mõõdeti fluorestsentsi spektrofotomeetriga (JASCO Corporation), ergastus lainepikkusel 457 nm, emissioon 490–535 nm juures.

2.6. DPPH radikaalsed testid

DPPH (250 µM) etanoolis segati sama koguse MES puhvriga (50 mM, pH 7,4). Sellele DPPH lahusele lisati Na2Sn-ga töödeldud HSA (40 μM), mida inkubeeriti seejärel 30 minutit 25 kraadi juures ja DPPH radikaalide neeldumist mõõdeti 540 nm juures. Püütud radikaalide määrad teisendati järgmise valemi abil;

Püütud radikaal ( protsenti )=(Abssample-Abspbs)/ Abspbs × 100

2.7. NO ja SNO analüüs

Na2Sn-ga töödeldud HSA-d (50 µM) inkubeeriti NO-doonoriga NOC7 (200 µM) 30 minutit 25 kraadi juures. Pärast reaktsiooni mõõdeti NO ja SNO kontsentratsiooni Griessi testiga väikeste muudatustega [25]. Griessi reaktiivi lahus valmistati 0,1 protsendi N-1- naftüületüleendiamiiddivesinikkloriidi ja 1 protsendi sulfaniilamiidi segamisel 2 protsendilises fosforhappes. Reaktsioonipuhver koosnes 0,1 M NaCl-st, 0,5 mM DTPA-st ja 10 mM AcONa・AcOH-st (pH 5,5). Proovid (20 μM) pandi reageerima Griessi reagendi lahusega (60 μL) reaktsioonipuhvris (110 μL) 3 mM HgCl2 lahusega 10 mM Naatsetaadis (pH 5,5). Pärast 15-minutilist inkubeerimist mõõdeti mikroplaadilugeja abil neeldumist lainepikkusel 540 nm. Ülejäänud NO/SNO suhe ( protsenti ) arvutati ja võrreldi proovide PBS väärtustega.

2.8. Rakukultuur

B16 melanoomirakud hankis Jaapani vähiuuringute ressursside pank (JCRB, Tokyo, Jaapan) ja neid kultiveeriti DMEM-is, mis sisaldas 10 protsenti veise loote seerumit ja antibiootikumilahust. Rakke kasvatati inkubaatoris temperatuuril 37 kraadi niisutatud õhus, mis sisaldas 5 protsenti CO2 (passaaži number 10–20).

2.9. Melaniini tootmine

B16 melanoomirakud külvati 24 süvendiga plaatidele kontsentratsiooniga 2,5 × 104 rakku süvendi kohta ja kultiveeriti 5% CO2 atmosfääris temperatuuril 37 kraadi 24 tundi. Proove töödeldi 0,4 mM türosiini ja 10 mM NH4Cl-ga DMEM-is, mis sisaldas 10% FBS-i, ja inkubeeriti seejärel 5% CO2 atmosfääris 37 kraadi juures 72 tundi. Pärast inkubeerimist pesti rakke kaks korda PBS-ga ja lahustati 1 N NaOH-s (200 µL). Pärast 2-tunnist inkubeerimist 60 kraadi juures mõõdeti neeldumist (405 nm) mikroplaadilugeja abil.

Cistanche pärsib melaniini tootmist.

2.10. UV-kiirgused

Proovide kiiritamiseks süvendiplaadist 5 cm kaugusel kasutati käeshoitavat UV-lampi. See UV-lamp tagab UV-i intensiivsuse vastavalt 614 või 743 μW/cm2 254 nm või 365 nm kiirgusega 5 cm kauguselt.

2.11. Na2S4-töödeldud HSA eemaldamisaktiivsus rakusisese ROS-i, NO, RSS-i vastu

ROS ja NO B16 melanoomirakkudes mõõdeti iga fluorestsentssondiga, vastavalt CM-H2DCF-DA ja DAF-FM-DA. B16 melanoomirakud külvati 96-süvendiga plaatidele kontsentratsiooniga 1 × 104 rakku süvendi kohta ja kultiveeriti 37-kraadises 5-protsendilises CO2 keskkonnas 24 tundi. Pärast kultiveerimist sööde eemaldati ja asendati CM-H2DCF-DA (5 μM) või DAF-FM-DA (10 μM) PBS-is. Sondid võeti rakkudesse, inkubeerides neid 37 kraadi juures 30 minutit. Pärast reaktsiooni eemaldati supernatandid, proove lahjendati PBS-is ja fluorestsentsi mõõdeti kohe. Rakke kiiritati UV-lambiga 15 minutit. Pärast kiiritamist mõõdeti fluorestsentsi intensiivsust (näit. 485 nm, Em. 535 nm) fluorestsents-mikroplaadilugeja abil.

2.12. Seene türosinaasi aktiivsus ja melaniini agregatsioon

Türosinaasi ja L-DOPA lahused valmistati vahetult enne analüüsi PBS-is (pH 7,4). Na2Sn-ga töödeldud HSA inhibeeriva toime uurimiseks kasutati seentest eraldatud türosinaasi. 20 µl seene türosinaasi (537 U/mL) ja 100 µl Na2Sn-ga töödeldud HSA-d (40 µM) segati hästi PBS-ga (60 µL) 96 süvendiga plaatidel ja lisati 20 µl L-DOPA-d (5 mM). seejärel lisati. Pärast 30-minutilist inkubeerimist analüüsiti sünteesitud melaniini taset, mõõtes OD 490 nm. Melaniini agregatsiooni testimiseks tsentrifuugiti segu 20,000 g, 15 minutit 3 tundi. Valge nool näitab koondmaterjali. Agregeerimata melaniini supernatandis mõõdeti OD 490 nm juures.

2.13. Ohutustestid

Selles uuringus kasutatud toopiline kreem valmistati vee (30 ml), jojobaõli (15 ml) ja 5 g emulgeeriva vaha segamisel 60 kraadi juures. Pärast jahutamist segati Na2S4--ga töödeldud HSA (20 μM) ja saadud suspensioon korralikult läbi. Nahaärrituse test viidi läbi vastavalt OECD testimisjuhisele 439, kasutades LabCyte Epi-Model (3D-kultiveeritud inimese nahamudel).

2.14. Statistiline analüüs

Kogutud andmete statistilist olulisust hinnati ANOVA analüüsiga, millele järgnes Newman-Keulsi meetod rohkem kui kahe keskmise puhul. Erinevusi rühmade vahel hinnati Studenti t-testiga. P < 0,05="" loeti="" statistiliselt="">

3. Tulemused

3.1. S-sulfideeritud HSA valmistamine

Na2Sn-ga töödeldud HSA valmistati HSA-st, mida oli inkubeeritud Na2Sn-ga ja mis allutati pärast reaktsiooni geelfiltrimisele. Proovis sisalduva sulfaanväävli koguse hindamiseks kasutati EMSP-d, uudset kvantitatiivset meetodit, mille oleme varem välja töötanud [24]. Seega valmistati Na2S4--ga töödeldud HSA HSA-st ja Na2Sn-st, lastes reaktiividel reageerida 1 tund 37 kraadi juures. Erinevatel kogustel naatriumpolüsulfiididel lasti reageerida HSA-ga. Seejärel inkubeeriti HSA proove EMSP lahusega, mis valmistati kasutamise ajal, 3 tundi 37 kraadi juures. EMSP analüüside põhjal tõusis S-sulfüdatsiooni tase väävli kogusest sõltumatult (joonis 1A). Teisest küljest, nagu on näidatud joonisel 1B, suurendas Na2S3- või Na2S4-töötlus SSP4 (sulfaanväävli fluorestsentssond) fluorestsentsi intensiivsust võrreldes Na2S- või Na2S{{24 }}ravi, mis viitab sellele, et SSP4 reageeris valgu polüsulfiidiga mittelineaarsel viisil (joonis 1B).

3.2. Na2S-ga töödeldud HSA antioksüdant ja NO supresseeriv toime

Me oletasime, et Na2Sn-ga töödeldud HSA pärsib melaniini tootmist selle antioksüdantse aktiivsuse tõttu. Seetõttu viidi antioksüdandi aktiivsuse in vitro analüüsimiseks läbi DPPH radikaali test [26, 27]. Selle tulemusena oli Na2Sn-ga töödeldud HSA-s oluliselt kõrgem lisatud väävli kontsentratsioon (joonis 2A). NO mõju selgitamiseks inkubeeriti NOC7 (NO doonor) koos Na2S{11}}-ga töödeldud HSA-ga 25 kraadi juures. Pärast 30-minutilist inkubatsiooniperioodi kvantifitseeriti järelejäänud NO kontsentratsioon Griessi testiga. Nagu on näha joonise 2B suletud ribadelt, püüdis Na2S4--ga töödeldud HSA-d oluliselt rohkem NO võrreldes kontroll- ja HSA-ga (joonis 2B). Elementaarne elavhõbe (Hg) vähendab teadaolevalt SNO-d ja vabastab NO{18}}. Kui Na2S4-töödeldud HSA lahusele lisati Hg, vabanes NO2-, mis viitab sellele, et Na2S4--ga töödeldud HSA eemaldati S-nitroseerimise teel.

3.3. Melaniin pärsib Na2Sn-ga töödeldud HSA toimet

B16 hiirte melanoomirakke kultiveeriti ja melaniini sünteesi soodustati söötmele türosiini lisamisega. Nagu on näidatud joonisel 3, inhibeeris Na2Sn-ga töödeldud HSA melaniini sünteesi ja inhibeerimine sõltus väävlisisaldusest. B16 melanoomirakkude rakupildid pärast Na2Sn-ga töödeldud HSA pealekandmist näitasid samuti, et Na2Sn-ga töödeldud HSA vähendas melaniini tootmise suhetpositiivseid rakke (joonis 3).

3.4. UV-kiirgusega töödeldud HSA-ga töödeldud Na2S{3}antioksüdantne toime

Et uurida, kas Na2Sn-ga töödeldud HSA pärssis UV-indutseeritud ROS-i või NO moodustumist, viidi läbi oksüdatiivne stressitest, kasutades mudelitena B16 melanoomirakke. ROS-i tootmist Na2S4-töödeldud HSA-ga B16 melanoomirakkudes kahe erineva UV-seadmega 15 minuti jooksul kiiritades mõõdeti CMH2-DCF-DA abil. Leiud näitavad, et Na2S4-töödeldud HSA põhjustas CMH2-DCF-DA fluorestsentsi olulise vähenemise PBS-i ja HSA-le kiiritamisel lainepikkustel 254 nm ja 365 nm (joonis 4AB). Vastupidi, Na2S4--ga töödeldud HSA pärssis ka NO tootmist B16 melanoomirakkudes kiiritades 254 nm UV-ga (joonis 4CD). Need tulemused näitavad, et Na2Sn-ga töödeldud HSA pärsib melaniini sünteesi, inhibeerides UV-kiirguse poolt toodetud ROS-i ja NO.

3.5. Türosinaasi ja melaniini agregatsiooni otsene pärssimine Na2Sn-ga töödeldud HSA-ga

Teatakse, et mõned kaubanduslikud melaniinivastased ained inhibeerivad otseselt türosinaasi aktiivsust. Seega testisime, kas Na2Sn-ga töödeldud HSA muutis türosinaasi aktiivsust. Leiud näitasid, et Na2Sn-ga töödeldud HSA inhibeeris seene türosinaasi suuremal määral kui töötlemata HSA (joonis 5A). Pärast tekkimist agregeerub melaniin kergesti ja kutsub esile medulla moodustumise [28]. Seetõttu käsitlesime järgmisena küsimust, kas Na2Sn-ga töödeldud HSA pärsib melaniini agregatsiooni. Järelikult, kui türosinaasi ja L-DOPA-d inkubeeriti koos 3 tundi, agregeerusid melaniini pigmendid, kuid Na2Sn-ga töödeldud HSA takistas agregatsiooni (joonis 5B). Ühest küljest leiti, et HSA pärsib ka agregatsiooni, mis näitab, et HSA ise võib takistada L-DOPA seondumist türosinaasiga.

3.6. Na2Sn-ga töödeldud HSA ohutustest, kasutades 3D kultiveeritud inimese nahka

Na2S4--ga töödeldud HSA nahaärrituse testid viidi läbi 3D-kultiveeritud inimese naharakkudega vastavalt OECD juhistele. Selle tulemusel ei vähenenud Na2S4--ga töödeldud HSA-ga paikse kreemiga või ilma selleta ellujäänud rakkude arv (joonis 6A). LDH tsütotoksilisuse tuvastamise komplekti kasutamine näitas ka, et Na2S4--ga töödeldud HSA ei kahjustanud naharakke (joonis 6B). Need andmed näitasid, et Na2Sn-ga töödeldud HSA on selles uuringus uuritud kontsentratsioonides inimese naha vastu väga ohutu.

4. Arutelu

Melaniini sünteesitakse türosiini oksüdatsiooni teel. Türosiin oksüdeeritakse türosinaasi toimel L-DOPA-ks ja seejärel dopakinooniks. Dopakinoon oksüdeerub spontaanselt melaniiniks. Melaniin indutseerib mustade pigmentide ja tedretähnide teket, kuid mängib rolli ka naha kaitsmisel UV-kiirguse kahjustuste eest. Inimese nahas toodavad melanotsüüdid UV-kiirguse mõjul ROS-i ja NO [2, 29, 30]. ROS soodustab melaniini sünteesi, aktiveerides türosinaasi ATP süntaasi, fenüülalaniini hüdroksülaasi ja MAPK-de fosforüülimise kaudu [31, 32]. NO aktiveerib türosinaasi, suurendades cGMP taset rakus [6]. Seetõttu peetakse ROS-i ja NO-püüdjaid melanogeneesivastasteks aineteks. Siin uurisime Na2Sn-ga töödeldud HSA melaniini sünteesivastast toimet. Na2Sn-ga töödeldud HSA surus tugevalt alla UV-kiirguse poolt toodetud ROS-i ja NO rakutasemeid (joonis 4). Veelgi enam, Na2Sn-ga töödeldud HSA-l oli otsene mõju türosinaasi toime (joonis 5A) ja melaniini agregatsiooni (joonis 5B) pärssimisele. Me ei suutnud selgitada mehhanismi, kuidas sulfaanväävel Na2Sn-ga töödeldud HSA-st rakku kanti. Seetõttu jääb Na2Sn-ga töödeldud HSA funktsiooni otsese mõju olemus ebaselgeks. Yamashita et al. näitas, et dopakinoon seondub tsüsteiinijääkide kaudu tioolvalkudega [33]. Kokkuvõttes võib melaniini agregatsiooni pärssimine HSA ja Na2Sn-ga töödeldud HSA poolt hõlmata ka disulfiidsidemete moodustumist dopakinooni või melaniiniga. Teisest küljest sõltus türosinaasi inhibeerimine lisatud väävli sisaldusest (joonis 5A). On teada, et GSH seob türosinaasi ja vähendab selle aktiivsust [34]. Kuna S-sulfhüdraaditud tsüsteiinil on tugevam reaktsioonivõime kui tavalisel tsüsteiinil [11], võib glutatioonpersulfiid (GSSH) pärssida türosinaasi toimet rohkem kui GSH. Tulevikus on vaja täiendavaid uuringuid selle kohta, kas Na2Sn-ga töödeldud HSA suurendab rakusisest GSSH-d.

ROS-id toodetakse UV-kiirguse või välise stressi mõjul vananemise märke mitte ainult melaniini sünteesi näol, vaid ka DNA kahjustusest ja ristseotud kollageeni moodustumisest põhjustatud kortsude ja naha lõtvumise näol. Samuti on teada, et ROS on erinevat tüüpi põletikku, nagu vistrikud ja psoriaas, raskendav tegur. Nende probleemide lahendamiseks on loodud mitmesuguseid nahka valgendavaid aineid, nagu traneksaamhape [35] ja arbutiin [36]. Need ühendid aga pärsivad ainult melaniini sünteesi ja neil puudub mõju oksüdatiivsele stressile. Seega säilisid ROS-i põhjustatud toksilisuse riskid. Na2Sn-ga töödeldud HSA kasutamise eeliseks on see, et see eemaldab tõhusalt ROS-i (joonised 2 ja 4).

Vesiniksulfiidi on uuritud kolmanda olulise molekulina pärast lämmastikoksiidi ja süsinikmonooksiidi. Vesiniksulfiidi terapeutiline toime on osutunud rakendatavaks isheemia/reperfusiooni [37], ateroskleroosi [38], sepsise [39] ja suure rasvasisaldusega dieedist põhjustatud toksilisuse [40] ravis. Lisaks on hüdropersulfiidil suurem aktiivsus kui vesiniksulfiidil. Näiteks Na2S4 detoksifitseerib tõhusalt metüülelavhõbedat ja pärsib neuroblastoomirakkude diferentseerumist, samas kui Na2S mitte [12,41]. Seetõttu ei ole Na2Sn-ga töödeldud HSA võimalik mitte ainult nahka valgendav toime, vaid ka muud positiivsed mõjud.

Kokkuvõtteks teatasime uudse RSS-i kohaletoimetamissüsteemi väljatöötamisest, kasutades stabiilse kandjana seerumi albumiini. Reaktiivsel väävlil oli HSA-ga kombineerituna tugevam antioksüdantne toime kui HSA ja see pärssis melaniini sünteesi melanoomirakkudes. Anti-melanogeneesi mehhanism hõlmab mitte ainult ROS-i ja NO eemaldamist, vaid ka türosinaasi aktiivsuse ja melaniini agregatsiooni pärssimist. Seega on Na2Sn-ga töödeldud HSA-l märkimisväärne potentsiaal kasutada ohutu nahavalgendajana.

See on meie toode.

Lisateabe saamiseks klõpsake pilti.