13-nädalane 2-(l-mentoksü)etanooli subkroonilise toksilisuse uuring F344 rottidel

Sissejuhatus

2-(1-mentoksü)etanool (CAS nr 38618-23-4) on selge ja värvitu iseloomuliku lõhnaga vedelik, mida kasutatakse laialdaselt lõhna- ja maitseainena. FAO/WHO ühine toidu lisaainete ekspertkomitee (JECFA) on hinnanud 2-(l-metoksü)etanool lõhna- ja maitseainena, mis liigitatakse mentooliga struktuurilt sarnaseks aineks1. Lõhna- ja maitseainete struktuuriklassi põhjal 2-(l-metoksü)etanool määrati I klassi. Ameerika Ühendriikides ja Euroopas on 2-(l-metoksü)etanooli kogus inimeste poolt oli hinnanguliselt vastavalt 12 ug inimese kohta päevas ja 0,01 ug inimese kohta päevas, mis mõlemad jäid alla I klassi läve 1800 ug inimese kohta päevas. Nende hinnangute põhjal leitakse, et 2-(1-mentoksü)etanool ei pruugi maitseainena tavapärasel kasutamisel tekitada ohutusprobleeme.

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(1-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 mg/kg kehakaalu kohta [BW])1. Vaatamata 2-(1-mentoksü)etanooli kasutamisele lõhna- ja maitseainena, on selle ühendi korduva manustamise toksilisuse kohta vähe andmeid. Meie labor on uurinud mitmete toidu lisaainete, sealhulgas iga kategooria tüüpiliste lõhna- ja maitseainete toksilisust näriliste mudelites 2–7. Toksikoloogilise profiili selgitamiseks ja jälgitava kahjuliku toime taseme (NOAEL) määramiseks viisime läbi 13-nädalase 2-(1-mentoksü)etanooli subkroonilise toksilisuse uuringu, mis oli manustati suukaudselt F344 rottidele sondiga.

Materjalid ja meetodid

Katsekemikaal

2-(1-mentoksü)etanool (partii nr 5I0002, puhtus 99,9%), tootja Takasago Int. Corp.-i (Tokyo, Jaapan) andis Jaapani tervishoiu-, töö- ja heaoluministeeriumi toiduohutuse osakonna standardite ja hindamise osakond Jaapani maitse- ja lõhnamaterjalide assotsiatsiooni (Tokyo, Jaapan) toel. Kuigi uuritav aine esitati optiliste isomeeride seguna (CAS nr 38618-23-4), kinnitas tootja selle l-enantiomeerina (CAS nr 75443-64-0). 2-(1-mentoksü)etanooli vees lahustumatuse ja lenduvuse tõttu valiti manustamisviisiks suukaudne sondiga maisiõli (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Jaapan). 2-(1-mentoksü)etanooli lahused valmistati iga päev vahetult enne manustamist. Pärast 2-tunnist toatemperatuuril hoidmist kinnitati, et 2-(1-mentoksü)etanooli jääksuhted 4, 40 ja 400 mg/ml lahuses on 96,8%, 99,8% ja 96,5%. , vastavalt gaasikromatograafia abil (Japan Inspection Association of Food and Food Industry Environment, Tokyo, Jaapan).

Katseloomad

Kokku osteti 40 isast ja 40 emast spetsiifilist patogeenivaba rotti (F344/DuCrlCrlj, 5 nädalat) ettevõttest Charles River Laboratories Japan (Yokohama, Jaapan) ja neid kasutati pärast ühenädalast aklimatiseerumist. Uuringu ajal peeti loomi polükarbonaadist puurides pehme laastu allapanuga, mida hoiti ruumis, kus oli valguse/pimeduse tsükli (12 h), ventilatsiooni (õhuvahetuskiirus 18 korda/h), temperatuuri ( 24 ± 1 kraadi) ja suhtelist õhuniiskust (55 ± 5%). Puure ja laastu allapanu vahetati kaks korda nädalas. Igal loomal oli tasuta juurdepääs kraaniveele ja põhitoidule (CRF-1; Oriental Yeast, Tokyo, Jaapan). Katse alguses jaotati loomad juhuslikult nelja rühma, igaühes 10 isast ja emast rotti, võttes aluseks kehamassi, mis mõõdeti vahetult enne uuritava kemikaaliga ravi alustamist.

Uuringu ülesehitus

Esialgses {{0}}päevases uuringus, milles hinnati 2-(1-mentoksü)etanooli, mida manustati annustes 0, 200, 400 ja 800 mg/kg BW/ päeval suurenes maksa absoluutne ja suhteline kaal märkimisväärselt kõigis mõlema soo ravitud rühmades (andmeid pole näidatud). Nende tulemuste põhjal valisime 2-(1-mentoksü)etanooli annused 0, 15, 60 ja 250 mg/kg kehamassi kohta päevas manustamiseks nii isastele kui ka emastele rottidele praegusel {{ 13}}nädalane toksilisuse uuring.

Üldisi seisundeid ja suremust hinnati iga päev. Katseperioodi jooksul mõõdeti üks kord nädalas kehamassi, samuti tarnitud ja järelejäänud toidukoguseid. Kõik rotid jäeti ravi lõppedes üleöö tühjaks ning hematoloogia ja seerumi biokeemia jaoks võeti vereproovid kõhuaordist sügava inhalatsioonianesteesia all, kasutades isofluraani. Uuringu ülesehitus lähtus Jaapani toidu lisaainete määramise ja toidu lisaainete kasutamise standardite läbivaatamise juhendist (1996) ning selle kiitis heaks Jaapani riikliku terviseteaduste instituudi loomade hooldamise ja kasutamise komitee.

Hematoloogia ja seerumi biokeemia

ProCyte Dx automaatsete hematoloogiliste analüsaatoritega (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, USA) analüüsiti järgmisi hematoloogilisi parameetreid: valgete vereliblede arv (WBC), punaste vereliblede arv (RBC), hemoglobiini kontsentratsioon (HGB), hematokrit (HCT), keskmine korpuskulaarne maht (MCV), keskmine korpuskulaarne hemoglobiin (MCH), keskmine korpuskulaarne hemoglobiini kontsentratsioon (MCHC), trombotsüütide arv (PLT) ja diferentsiaalsed leukotsüütide rakud, sealhulgas neutrofiilid (Neut), lümfotsüüdid (lümf), monotsüüdid (monotsüüdid), eosinofiilid (Eosino) ja basofiilid (Baso). Seerumi biokeemiline analüüs viidi läbi Oriental Yeast'iga järgmiste parameetrite jaoks: üldvalk (TP), albumiin (Alb), albumiini/globuliini suhe (A/G), üldbilirubiin (Bil), glükoos, üldkolesterool (T-Chol), triglütseriid (TG), uurea lämmastik (BUN), kreatiniin (Cre), kaltsium (Ca), anorgaaniline fosfor (IP), naatrium (Na), kaalium (K), kloor (Cl), aspartaataminotransferaas (AST), alaniinaminotransferaas (ALT), aluseline fosfataas (ALP) ja -glutamüültranspeptidaas (-GTP).

Elundite kaal ja histopatoloogiline hindamine

Kõigile loomadele viidi läbi täielik lahkamine ning kaaluti aju, harknääre, kopse, süda, põrn, maks, neerupealised, neerud, munandid ja munasarjad. Need elundid, aga ka seljaaju, kolmiknärvi, hüpofüüsi, ninaõõne, süljenäärmete, keele, söögitoru, hingetoru, aordi, kilpnäärme, kõrvalkilpnäärme, kõhunäärme, mao, peen- ja jämesoole, submandibulaarse ja soolestiku kuded lümfisõlmed, tupp, emakas, kusepõis, eesnääre, seemnepõiekesed, munandimanust, reieluu ja rinnaku koos luuüdiga, selgroolülid, skeletilihased, istmikunärv, nahk ja piimanääre fikseeriti 10% neutraalse puhverdatud formaliiniga; seejärel valmistati parafiiniga manustatud lõigud ja värviti histopatoloogiliseks uurimiseks hematoksüliini ja eosiiniga. Harderi näärmetega munandid ja silmad fikseeriti vastavalt Bouini fiksaatoris ja Davidsoni lahuses. Luukoed, sealhulgas ninaõõs, selgroolülid, rinnaku ja reieluu, eemaldati katlakivist 10% sipelghappe ja 10% puhverdatud formaliini seguga kuni 2 nädala jooksul. Histopatoloogiline hindamine viidi läbi kõigi kontrollrühma loomadelt saadud kudede puhul ja rühmale manustati suurim annus, välja arvatud juhul, kui täheldati raviga seotud kahjustusi.

LOODUSLIK TUBULOOS IMmuunsuse PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2u-globuliini immunohistokeemia

Isastel rottidel uuriti 2u-globuliini akumuleerumist neerudes parafiiniga manustatud lõikude immunohistokeemilise analüüsiga. Antigeeni otsimiseks inkubeeriti igas rühmas 5 rotilt saadud sektsioone proteinaas K-ga (DAKO, Glostrup, Taani) 1 minut toatemperatuuril. Endogeense peroksidaasi aktiivsuse inaktiveerimiseks sukeldati kõik sektsioonid 10 minutiks toatemperatuuril 3% H2O2/metanooli lahusesse. Pärast mittespetsiifiliste reaktsioonide blokeerimist 10% normaalse küüliku seerumiga inkubeeriti sektsioone 2uglobuliini primaarse antikehaga (lahjendatud 1:400; rotivastane 2u-globuliini antikeha; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) üle öö temperatuuril 4 kraadi 8. Antikehade seondumise visualiseerimine viidi läbi, kasutades VectaStain Elite ABC komplekti (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) ja 3,3'-diaminobensidiini. Kõik lõigud värviti hematoksüliiniga.

Statistiline analüüs

Katseperioodi kehakaalu, samuti hematoloogia, seerumi biokeemia ja elundite massi andmete väärtuste erinevusi hinnati homogeensuse suhtes Bartletti testi abil. Homogeensete ja heterogeensete andmete jaoks kasutati vastavalt ühesuunalist dispersioonanalüüsi ja Kruskal-Wallise testi. Statistiliselt oluliste erinevuste määramisel kasutati kontroll- ja ravirühmade võrdlemiseks Dunnetti mitmekordset võrdlustesti. Histopatoloogiliste esinemissageduste ja astmete võrdlusi analüüsiti, kasutades vastavalt Fisheri täpse tõenäosuse testi ja Mann-Whitney U-testi. P väärtused<0.05 were considered statistically significant.

Tulemused

Eluaegsed parameetrid, hematoloogia ja seerumi biokeemia

Kogu katseperioodi jooksul ei täheldatud olulisi kliinilisi tunnuseid ja kõik loomad elasid kuni kavandatud lahkamiseni. Peale selle ei täheldatud isas- ja emasrottidel olulisi erinevusi kehakaalus ja päevases toidutarbimises (joonis 1A ja B).

Hematoloogilised ja seerumi biokeemilised andmed on näidatud vastavalt tabelites 1 ja 2. Hematoloogilised analüüsid näitasid oluliselt vähenenud HGB, HCT, MCV ja MCH ning suurenenud PLT isastel rottidel, kellele manustati 250 mg/kg kehamassi kohta päevas 2-(1-mentoksü)etanooli (tabel 1). Seerumi biokeemias täheldati 250 mg/kg rühma meestel TP, T-Chol ja Ca olulist suurenemist ning Bil ja ALP vähenemist (tabel 2). 60 ja 250 mg/kg rühmade meestel täheldati Cre märkimisväärset suurenemist ja A/G langust. Naistel registreeriti 60 ja 250 mg/kg rühmades Ca sisalduse oluline suurenemine ja ALP vähenemine, samas kui 250 mg rühmas tuvastati kõrgenenud T-Chol ja vähenenud A/G, Bil, TG, AST ja ALT. /kg rühm. Kuigi meestel, kellele manustati 60 mg/kg, täheldati olulist TG tõusu ja Cl vähenemist, viitas dooside seose puudumine sellele, et need erinevused ei olnud seotud uuritava ainega kokkupuutega.

Organite kaalud

Andmed elundite massi kohta on kokku võetud tabelis 3. Maksa absoluutne ja suhteline kaal suurenesid märkimisväärselt mõlemast soost 250 mg/kg rühmas (tabel 3). 60 mg/kg rühma meestel täheldati maksa suhtelise kaalu märkimisväärset suurenemist. Meestel suurenes neerude absoluutne ja suhteline kaal 60 ja 250 mg/kg rühmades oluliselt. 250 mg/kg meeste rühmas täheldati neerupealiste absoluutse ja suhtelise massi ning põrna ja munandite suhtelise massi märkimisväärset suurenemist.

Histopatoloogia ja immunohistokeemia

Histopatoloogiliste ja immunohistokeemiliste leidude andmed on kokku võetud vastavalt tabelites 4 ja 5. Histopatoloogilised leiud näitasid, et eosinofiilsete graanulite (joonis 2A–D), basofiilsete tuubulite ja hüaliinikipsi kogunemise sagedus, samuti fokaalne interstitsiaalne põletik neerudes, suurenesid meestest koosnevates ravirühmades võrreldes kontrollrühmaga oluliselt. rühm (tabel 4). Immunohistokeemiliste analüüside põhjal ilmnes uuritava ainega ravitud isastel rottidel 2u-globuliini immunoreaktiivsuse suurenemine proksimaalsete tuubulite epiteelirakkudes, mis näitab selget annusesõltuvust (joonis 2E–H) (tabel 5).

Lahkamisel ilmnes ühel isasel rotil 250 mg/kg rühmas parema neeru tõsine suurenemine histoloogiliselt iseloomuliku nefroblastoomi tõttu. Kuigi nefroblastoom on enamiku roti tüvede puhul aeg-ajalt9, peeti seda juhtumit juhuslikuks, kuna ühelgi teisel loomal ei esinenud sarnaseid kahjustusi. Lisaks jäi suukaudse manustamise kantserogeensuse uuringutes spontaanse nefroblastoomi esinemissagedus isastel F344/DuCrlCrlj rottidel väidetavalt vahemikku 0–2,0%10. Kuigi teistes elundites avastati sporaadiliselt mitmeid kahjustusi, ei ilmnenud nende kahjustuste esinemissageduses olulisi ravist sõltuvaid muutusi.

Arutelu

Praeguseks on JECFA hinnanud 24 lõhna- ja maitseainet, sealhulgas 2-(1-mentoksü)etanooli mentooliga struktuurilt sarnaseks aineks ja kõik on praeguse hinnangulise taseme juures loetletud kui "ohutusprobleemid". sissevõtmisest1, 11. 2-(1-Mentoksü)etanool on klassifitseeritud alitsükliliste alkoholide või eetrite alarühma ja seda peetakse peamiselt konjugeerituks glükuroonhappega, millele järgneb uriiniga eritumine1. Kuigi nende ainete suukaudsed LD50 väärtused närilistel on suhteliselt kõrged, on korduvannuse toksilisuse uuringute andmed piiratud. 13-nädalane korduvannuse toksilisuse uuring näitas, et mentüülpürrolidoonkarboksülaati (CAS nr 68127-22-0), mis on struktuurilt mentooliga sarnane ühend, võib seostada maksa ja neerude suhtelise kaalu suurenemisega meestel ja naistel. Wistari rotid. 2u-globuliini akumuleerumist isaste rottide proksimaalsetesse tuubulitesse täheldati ka annuse 1111 mg/kg kehamassi kohta päevas ja NOAEL määrati 109 mg/kg kehamassi kohta päevas1.

Käesolevas 13-nädalases 2-(1-mentoksü)etanooli subkroonilise toksilisuse uuringus ei täheldatud toksikoloogilisi muutusi üldises seisundis, kehakaalus ja toidutarbimises. Pärast hematoloogilist hindamist täheldasime meestel HGB (96,6% kontrollväärtuste), HCT (96,3%), MCV (98,4%) ja MCH (98,2%) vähenemist ning PLT suurenemist (111%). 250 mg/kg, mida peeti 2-(1-mentoksü)etanooliga töötlemise toksikoloogilisteks mõjudeks. Nii absoluutne (115% mõlemast soost) kui ka suhteline (119% meestel ja 111% naistel) maksa kaal suurenes mõlemal sugupoolel märkimisväärselt 250 mg/kg rühmas. Kuigi maksas histopatoloogilisi muutusi ei esinenud, suurenes seerumi T-Chol (meestel 110% ja naistel 121%) ja TP (meestel 105%) ning TG vähenemine (naistel 60,1%) 250. eluaastal. mg/kg rühmad näitavad toksilisi muutusi, mis on seotud lipiidide metabolismi ja valkude sünteesiga maksas. Samuti tuvastati vähenenud HGB ja MCH ning kõrgenenud PLT, T-Chol ja TP meestel ning vähenenud TG ning suurenenud absoluutne ja suhteline maksa kaal mõlemal sugupoolel, millel on statistiline olulisus 28-päevases eeluuringus (andmeid ei ole näidatud). ), mis kinnitab, et need muutunud hematoloogilised ja seerumi biokeemilised parameetrid, samuti maksa kaal, ei olnud juhuslikud, vaid katseainega seotud mõjud. Seevastu käesolevas uuringus 60 mg/kg meeste rühmas tuvastatud maksa suhtelise kaalu olulise suurenemisega ei kaasnenud absoluutmassi suurenemist ega muutusi seotud biokeemilistes parameetrites, mis viitab sellele, et see tõus oli adaptiivne muutus.

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Uuritava kemikaaliga seostati meeste rühmas 250 mg/kg märkimisväärselt suurenenud neerupealiste absoluutmassi (120%) ja suhtelist (118%). Lisaks näitas mõlema soo neerupealiste suurenenud absoluutne ja suhteline kaal 28-päevases eeluuringus (andmeid pole näidatud) selget annusest sõltuvust, mis näitab seost uuritava kemikaaliga töötlemisega. Kuigi neerupealiste hüpertroofia võib tuleneda stressist, ei leitud nii käesolevates kui ka esialgsetes uuringutes stressile viitavaid leide, nagu vähenenud kehakaalu tõus või harknääre ja teiste lümfoidorganite atroofia. Kuna steroidogeneesiga seotud ensüümide pärssimise korral ei pruugi neerupealistes esineda histopatoloogilisi muutusi isegi glükokortikoidide tootmise häire korral12, ei saa välistada võimalust, et neerupealiste massi suurenemine on toksiline leid. Seevastu põrna ja munandite suhtelise massi suurenemist meessoost 250 mg/kg rühmas, mida eeluuringus ei täheldatud, peeti toksikoloogiliselt ebaoluliseks histopatoloogiliste kahjustuste puudumise või oluliselt suurenenud absoluutkaalu tõttu. Sarnaselt näitas seerumi biokeemia A / G vähenemist ja Ca suurenemist mõlemal sugupoolel, millel ei peetud toksikoloogilist tähtsust, arvestades, et seotud parameetrites ei tuvastatud kõrvalekaldeid. Lisaks olid Bil- ja ALP-tasemete vähenemine mõlemast soost ning AST-i ja ALAT-i vähenemine naistel vastupidine eeldatavale toksilisele toimele ja neid ei peetud oluliseks.

Kroonilist nefropaatiat, mida iseloomustasid basofiilsed tuubulid, hüaliinikips ja fokaalne interstitsiaalne põletik, täheldati statistilise olulisusega kõigi ravitud rühmade meestel. Lisaks tuvastati meeste rühmades 60 ja 250 mg/kg suurenenud seerumi Cre ning absoluutne ja suhteline neerukaal; neid muutusi ei täheldatud naiste ravirühmades. Nendel juhtudel suurenes eosinofiilsete graanulite kuhjumine proksimaalsetes tubulaarsetes epiteelirakkudes näiliselt annusest sõltuval viisil. Need graanulid kinnitati immunohistokeemiaga 2u-globuliinina, mis näitab 2u-globuliini nefropaatia esinemist. Teatud kemikaalidega, nagu d-limoneen, seotud 2u-globuliinid akumuleeruvad lüsosoomidesse ja neid täheldatakse proksimaalsetes tuubulites eosinofiilsete või hüaliinsete graanulitena9. See kogunemine võib kahjustada epiteelirakke, põhjustades kroonilist progresseeruvat nefropaatiat ja sellest tulenevat kasvaja moodustumist9. Seega, kuigi isaste rottide neerude 2u-globuliini nefropaatiaga seotud 2-(1-mentoksü)etanooli NOAEL-i ei tuvastatud, on seda tüüpi nefropaatia teadaolevalt spetsiifiline isasrottide puhul ega ole seega inimese jaoks asjakohane. riski hindamine13. 2u-globuliini akumulatsiooniga seotud mehhanismide kaudu vahendatud neerupuudulikkuse suurenenud risk on väga ebatõenäoline, kuna see valk inimestel puudub14. Seetõttu peeti mõistlikuks jätta NOAEL-i määramisest välja meestel täheldatud kroonilise nefropaatiaga seotud muutused.

Kokkuvõttes näitas käesolev 13-nädalane subkroonilise toksilisuse uuring, et 250 mg/kg kehamassi/päevas 2-(1-mentoksü)etanooliga ravi põhjustas toksilisi muutusi hematoloogias, seerumi biokeemias ja elundite massis. isastel ja emastel F344 rottidel. Vaadeldud tulemuste põhjal on 2-(1-mentoksü)etanooli NOAELmõlema soo puhul hinnati 60 mg/kg kehamassi kohta päevas.

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%